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Characterisation of the mitotic Kinesin 13-1 in Trypanosoma brucei

Title data

Riemer, Anna:
Characterisation of the mitotic Kinesin 13-1 in Trypanosoma brucei.
Bayreuth , 2018 . - VIII, 174 p.
( Doctoral thesis, 2018 , Universität Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT)
DOI: https://doi.org/10.15495/EPub_UBT_00003639

Official URL: Volltext

Abstract in another language

Trypanosoma brucei is a unicellular, uniflagellated parasite causing sub-Saharan African trypanosomiasis, commonly known as sleeping sickness. In the effort to eradicate this disease, finding new drugs that are without severe side effects for patients and easy to administer, is a challenging task. This thesis assesses the mitotic kinesin TbKif13-1 as potential drug target. Attempts were made to establish the prerequisites for an in vivo and an in vitro TbKif13-1 high-throughput inhibitor screen with automated image analysis. The basis for both assays was the TbKif13-1 mediated microtubule depolymerisation and its prevention by an appropriate inhibitor. In the in vivo assay, the substrate was the interphase microtubulule cytoskeleton of HeLa cells. The prerequisite for this assay is a stable HeLa cell line exhibiting a depolymerised microtubule cytoskeleton after inducible overexpression of eGFPTbKif13-1 S143A. The mutation prevents its inhibition by phosphorylation. The basic idea worked well in transiently transfected HeLa cells. However, generated stable cell lines did not show microtubule cytoskeleton depolymerisation after eGFPTbKif13-1 S143A overexpression. In the in vitro assay, the depolymerisation substrate for recombinantly purified His6TbKif13-1 were T. brucei cytoskeletons. The assay worked well on microscopy slides. However, it did not work in the prerequisited format, 384-well plates.
In this thesis functional characterisation of TbKif13-1 domains occurred, using TbKif13-1 deletion constructs for T. brucei in vivo and in vitro assays. Immunfluorescence studies indicated that the intranuclear TbKif13-1 localisation depends on a balance of several NLS and NES, with the strongest NLS in the C-terminus. TbKif13-1 was proteasome-dependent degraded and was not found in G1 cells. Degradation signals were supposed within its N- and C-terminus. Full-length TbKif13-1 bound in mitotic cytoskeleton samples in a shape resembling the mitotic spindle. In vitro it bound to and depolymerised taxol-stabilised microtubules in an ATP-dependent manner. The neck-motor domain in conjunction with the C-terminus was found to be its minimal functional construct for in vitro microtubule binding and depolymerisation. The decoupled mechanism of depolymerisation and ATPase activity is conserved in TbKif13-1. Ectopic expression of full-length TbKif13-1 led to reduced growth, zoid formation and defects in spindle formation. This dominant-negative phenotype was strongest after ectopic expression of the neck-motor domain. An expected inhibitory regulation of TbKif13-1´s depolymerisation activity by TbAuk1 mediated phoshorylation could not be confirmed.

Abstract in another language

Trypanosoma brucei ist ein einzelliger Parasit, der eine Flagelle besitzt. Er verursacht südlich der Sahara die afrikanische Trypanosomiasis, die allgemein als Schlafkrankheit bekannt ist. Eine anspruchsvolle Aufgabe beim Bekämpfen dieser Krankheit ist es, neue Medikamente zu finden, die ohne schwerwiegende Nebenwirkungen für den Patienten sowie einfach zu verabreichen sind. Diese Arbeit betrachtet das mitotische Kinesin TbKif13-1 als ein potentielles Angriffsziel für Medikamente. Es wurde versucht, die Vorraussetzungen für eine in vivo und eine in vitro Suche nach einem TbKif13-1 Inhibitor im Hochdurchsatz mit automatisierter Bildanalyse zu schaffen. Die Grundlage beider Analysemethoden war die durch TbKif13-1 vermittelte Depolymerisation von Mikrotubuli und deren Verhinderung durch einen passenden Inhibitor. Im in vivo Versuchsaufbau diente das Mikrotubulizytoskelett von HeLa Zellen in Interphase als Substrat. Die Vorraussetzung für diesen Versuch war eine stabile HeLa Zelllinie, die nach der induzierten Überexpression von eGFPTbKif13-1 S143A ein depolymerisiertes Zytolskelett aufweist. Die eingebrachte Mutation verhinderte dabei seine Inhibition durch Phosphorylierung. Die Grundidee funktionierte in transient transfizierten HeLa Zellen. Allerdings zeigten die erzeugten stabilen Zelllinien keine Depolymerisation des Mikrotubulizytokeletts nach eGFPTbKif13-1 S143A Überexpression. Im in vitro Versuchsaufbau dienten T. brucei Zytoskelette als Depolymerisationssubstrat für rekombinant aufgereinigtes His6TbKif13-1. Dieser Versuch funktionierte gut auf Objektträgern. Jedoch funktionierte er nicht auf den vorausgesetzten 384-well Platten.
In dieser Arbeit wurden TbKif13-1 Domänen funktionell charakterisiert, indem TbKif13-1 Deletionskonstrukte in in vivo und in in vitro Versuche eingesetzt wurden. Immunfluoreszenz-Studien zeigten, dass die intranukleäre TbKif13-1 Lokalisation von einem Gleichgewicht verschiedener NLS und NES abhängt, mit der stärksten NLS im C-Terminus. TbKif13-1 wurde Proteasom-abhängig abgebaut und war in G1 Zellen nicht zu finden. Abbausignale wurden im N- und C-Terminus vermutet. TbKif13-1, in seiner vollen Länge, band in mitotischen Zytoskelettproben in einer Form, die an die mitotische Spindel erinnert. In vitro band es an Taxol stabilisierte Mikrotubuli und depolymerisierte diese ATP abhängig. Die neck-motor Domäne in Verbindung mit dem C-Terminus erwies sich als das minimal funktionelle Konstrukt für das Binden an und das Depolymerisieren von Mikrotubuli in vitro. Der entkoppelte Mechanismus von Depolymerisation und ATPase Aktivität ist in TbKif13-1 konserviert. Die ektopische Expression des TbKif13-1 in seiner vollen Länge führte zu reduziertem Wachstum, der Ausbildung von Zoiden und Defekten in der Ausbildung der Spindel. Dieser dominant-negative Phänotyp war am stärksten nach der ektopischen Expression der neck-motor Domäne ausgeprägt. Eine erwartete inhibierende Regulation der Depolymerisationsaktivität von TbKif13-1 durch eine TbAuk1-vermittelte Phosphorylierung konnte nicht bestätigt werden.

Further data

Item Type: Doctoral thesis
Keywords: Trypanosoma brucei; Kinesin; microtubule depolymerisation; ATPase activity
Institutions of the University: Faculties > Faculty of Biology, Chemistry and Earth Sciences > Department of Biology > Professorship Genetics > Professorship Genetics - Univ.-Prof. Dr. Klaus Ersfeld
Graduate Schools > University of Bayreuth Graduate School
Graduate Schools > Bayreuth Graduate School of Mathematical and Natural Sciences (BayNAT)
Faculties
Faculties > Faculty of Biology, Chemistry and Earth Sciences
Faculties > Faculty of Biology, Chemistry and Earth Sciences > Department of Biology
Faculties > Faculty of Biology, Chemistry and Earth Sciences > Department of Biology > Professorship Genetics
Graduate Schools
Result of work at the UBT: Yes
DDC Subjects: 500 Science > 570 Life sciences, biology
Date Deposited: 25 May 2019 21:00
Last Modified: 25 May 2019 21:00
URI: https://eref.uni-bayreuth.de/id/eprint/49119