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Activation of the human Mediator kinase CDK8 by MED12

Title data

Klatt, Felix:
Activation of the human Mediator kinase CDK8 by MED12.
Bayreuth , 2020 . - IX, 141 p.
( Doctoral thesis, 2020 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)
DOI: https://doi.org/10.15495/EPub_UBT_00005202

Official URL: Volltext

Abstract in another language

Eukaryotic transcription is regulated by the Mediator kinase module, which phosphorylates transcription-related targets and controls the association of Mediator and RNA polymerase II. The activity of its catalytic heart, cyclin-dependent kinase 8 (CDK8), is regulated by Cyclin C and the Mediator subunit MED12, with its malfunction contributing to numerous malignancies.
To unravel how CDK8 activation is enhanced by MED12, I established recombinant expression and purification schemes that resulted in monodisperse, highly pure binary CDK8/Cyclin C and ternary CDK8/CycC/MED12 complexes. Using these complexes, I combined in vitro biochemistry, cross-linking coupled to mass spectrometry, and in vivo studies to decipher how the N-terminal portion of MED12 binds on the CDK8/Cyclin C complex and to gain mechanistic insights into the MED12-dependent CDK8 activation.
The data presented in my thesis demonstrate that the N-terminal part of MED12 wraps around CDK8, whereby it places an “activation helix” in direct proximity to the CDK8 T-loop for its activation. Interestingly, mutations in the activation helix that are frequently found in cancers do not alter the affinity of MED12 for CDK8, yet likely alter the exact positioning of the activation helix resulting in impaired CDK8 activity. Moreover, we find the transcriptome-wide gene-expression changes in human cells that result from a mutation in the MED12 activation helix to correlate with deregulated genes in breast and colon cancer. Finally, functional assays in the presence of kinase inhibitors reveal that MED12 binding reshapes the active site of CDK8 and thereby precludes the inhibition of ternary CDK8 complexes by type II kinase inhibitors. Taken together, these data establish that a newly identified activation helix in MED12 functionally replaces CDK8 T-loop phosphorylation and thereby likely remodels the active site. These data not only allow us to propose a revised model of how CDK8 activity is regulated by MED12, yet they have significant implications to drug development and will pave the road to new and specific CDK8 inhibitors that target CDK8 in its MED12-bound form.

Abstract in another language

Das humane Mediator Kinasemodul reguliert eukaryotische Transkription durch die Phosphorylierung von Transkriptionsfaktoren und durch die Modulation der Interaktion des Mediatorkomplexes mit RNA Polymerase II. Die enzymatische Aktivität des Kinasemoduls basiert dabei auf der Cyclin-abhängiger Kinase 8 (CDK8), welche von Cyclin C und MED12 kontrolliert wird. Wichtig ist, dass viele Krebserkrankungen mit der Fehlregulation von CDK8 assoziiert sind. Um den MED12-abhängigen Mechanismus der CDK8 Aktivierung auf molekularer Ebene zu entschlüsseln, habe ich rekombinante Expressions- und Reinigungs-methoden für Proteinkomplexe etabliert, welche neben CDK8 und Cyclin C zusätzlich MED12 beinhalten. Diese gereinigten, monodispersen Proteinkomplexe wurden mittels in vitro Biochemie, chemischer Quervernetzung gekoppelt mit Massenspektrometrie und in vivo Experimenten dahingehend analysiert, um die Bindung des N-terminalen Segments von MED12 an den CDK8/Cyclin C Komplex zu charakterisieren und um mechanistische Details über die MED12-abhängige CDK8 Aktivierung zu erhalten.
Die Ergebnisse zeigen, dass sich MED12 um CDK8 herum windet. Dabei platziert MED12 eine „Aktivierungshelix“ in der Nähe des T-loops von CDK8, was eine signifikante Stimulation der CDK8 Kinaseaktivität nach sich zieht. Darüber hinaus untersuchten wir besonders häufige, mit Krebs in Verbindung stehende MED12 Mutationen in der Aktivierungs-helix. Interessanterweise stören diese Mutationen nicht die Interaktion von MED12 mit dem CDK8/Cyclin C Komplex, sondern sie veränderten höchstwahrscheinlich die exakte Platzierung der Aktivierungshelix, was mit einer deregulierten Kinaseaktivität korreliert. Zudem konnte gezeigt werden, dass durch eine Mutation in der MED12 Aktivierungshelix krebsartige Genexpressionsprofile von Brust- und Darm-Krebs in menschlichen Zellen hervor-gerufen werden. Abschließende funktionale Studien mit Kinaseinhibitoren zeigten ferner, dass die Bindung von MED12 an CDK8 dessen aktives Zentrum strukturell verändert, wodurch die Bindungsaffinität und somit auch die Wirkung von Typ II Kinaseinhibitoren gegenüber CDK8 drastisch reduziert wird. Zusammengefasst wurde eine neue Aktivierungshelix in MED12 entdeckt, die auf funktionaler Ebene die allgemein notwendige Phosphorylierung des T-loops in CDK8 ersetzt, wobei das aktive Zentrum der Kinase verändert wird. Diese Ergebnisse sind Grundlage eines neuen Models der MED12-abhängigen Regulation der Kinaseaktivität von CDK8. Zusätzlich legt diese Arbeit nahe alle zukünftigen CDK8 Inhibitoren gegen MED12-gebundene CDK8 Komplexe zu entwickeln.

Further data

Item Type: Doctoral thesis
Keywords: CDK8; MED12; Mediator kinase module; Mediator; kinase inhibitors
Institutions of the University: Graduate Schools > University of Bayreuth Graduate School
Graduate Schools > Bayreuth Graduate School of Mathematical and Natural Sciences (BayNAT) > Molecular Biosciences
Graduate Schools > Elite Network Bavaria > Structural Basis of Gene Regulation by Non-coding RNA
Graduate Schools
Graduate Schools > Bayreuth Graduate School of Mathematical and Natural Sciences (BayNAT)
Graduate Schools > Elite Network Bavaria
Result of work at the UBT: Yes
DDC Subjects: 500 Science > 500 Natural sciences
500 Science > 570 Life sciences, biology
Date Deposited: 19 Dec 2020 22:00
Last Modified: 21 Dec 2020 08:00
URI: https://eref.uni-bayreuth.de/id/eprint/61331