Signalwege und Toleranzfaktoren für die Anpassung an Hypoxie und Überflutung in Arabidopsis thaliana

Titelangaben

Riber, Willi:
Signalwege und Toleranzfaktoren für die Anpassung an Hypoxie und Überflutung in Arabidopsis thaliana.
Bayreuth , 2015 . - IV, 121 S.
( Dissertation, 2015 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Arabidopsis thaliana wurde in dieser Arbeit verwendet, um Signalwege und Anpassungsmechanismen zu untersuchen, die die Toleranz gegen Überflutung und Hypoxiestress beeinflussen.
Eine Gruppe von 49 Genen wird bei Hypoxie in verschiedensten Arabidopsis-Zelltypen verstärkt exprimiert (Mustroph et al. 2009). Eine Durchsuchung von Microarray-Datenbanken nach Mutanten, die eine differentielle Regulation dieser Gene aufweisen, führte zu der Entdeckung eines Microarrays der EMS-Mutante ged1, der eine Hochregulation von 36 der 49 hypoxie-responsiven Gene bei Normoxie zeigt.
Durch die Kartierung von ged1 wurde eine Mutation in dem Gen PRT6 gefunden und damit ein neues Allel einer prt6-Mutante in einem Wassilewskija Hintergrund. PRT6 ist eine Ubiquitin Ligase, deren Bedeutung als essentielles Enzym in einem durch den N-end rule pathway vermittelten Sauerstoffwahrnehmungsmechanismus zu jener Zeit gerade durch zwei unabhängige Publikationen bekannt wurde (Gibbs et al. 2011, Licausi et al. 2011).
Ged1 wurde mit der T-DNA Insertionslinie prt6-1 in einem Col-0 Hintergrund verglichen. Beide Mutanten erwiesen sich in Überflutungsexperimenten toleranter als ihre jeweiligen Wildtypen.
Diese Beobachtung steht in Widerspruch zu veröffentlichten Überflutungsexperimenten, in denen prt6-Mutanten ähnlicher ökotypischer Hintergründe verwendet worden waren. Diese zeigen eine Intoleranz der Mutanten (Licausi et al. 2011, Weits et al. 2014). Zusätzlich unterscheiden sich die Überflutungsexperimente in der Überlebensdauer aller Genotypen. Diese sind in den publizierten Experimenten um bis zu einem Vielfachen kürzer.
Die Luftfeuchtigkeit während der Erholungsbehandlung konnte als Grund für diese Unterschiede zwischen den Experimenten verantwortlich gemacht werden, was darauf hindeutet, dass prt6-Mutanten bei Wiederbelüftung anfällig für eine verringerte Wasseraufnahme durch die Wurzel sind.
Interessanterweise zeigte ged1 in den hier dargestellten Überflutungsexperimenten im Gegensatz zu den anderen Genotypen höhere Lt50 Werte bei Überflutung in Dunkelheit als bei Dunkelheit an der Luft.
Diese Beobachtung konnte mit einem etwa vierfach höheren Kohlenhydratgehalt, einschließlich Stärke, Saccharose, Glukose und Fruktose, in Rosettenblättern von ged1 nach 24 h Überflutung im Vergleich zur Luftbehandlung in Verbindung gebracht werden. Ein ähnlicher Unterschied im Kohlenhydratgehalt wurde in prt6-1 festgestellt, obwohl dieser Genotyp eine im Vergleich zur Luftbehandlung geringere Überlebenswahrscheinlichkeit bei Überflutung aufwies.
Beide Mutanten zeigten nach 24 h Überflutung in Dunkelheit einen etwa zweifach höheren Kohlenhydratgehalt als die Wildtypen. Dagegen gab es keine signifikanten Unterschiede im Kohlenhydratgehalt nach 24 h Dunkelheit an der Luft, obwohl beide prt6-Mutanten in verschiedenen Dunkelheit-Überlebensexperimenten an der Luft toleranter waren als die jeweiligen Wildtypen und eine verzögerte Seneszenz aufwiesen.
Demzufolge hängt der verringerte Kohlenhydratverbrauch bei Überflutung von Hypoxie- und/oder Überflutungs-induzierten Signalen ab, findet aber verstärkt in prt6-Mutanten statt.
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine Ausschaltung des N-end rule pathway eine Herrunterregulation des Kohlenhydratverbrauchs und einen ökonomischeren Umgang mit Energieressourcen bewirkt, obwohl gleichzeitig die Expression vieler Gene erhöht wird, die an Zuckerabbau und Fermentation beteiligt sind.
Darüber hinaus konnten bestimmte Phänotypen von N-end-rule pathway-Mutanten, nämlich ein Abscisinsäure-hypersensitives Anhalten der Keimlingsetablierung und die Fähigkeit lange Dunkelperioden zu überleben mit der Aktivität von ERF-VII Transkriptionsfaktoren in Verbindung gebracht werden, die selbst unter Kontrolle des N-end-rule pathway stehen.
Ein mögliches neues Zielprotein des N-end-rule pathway, der Transkriptionsfaktor ABR1 (ABA REPRESSOR1) wurde charakterisiert. Das Transkriptlevel von ABR1 ist bei Anoxie-Behandlung stark hochreguliert. Überexpressionslinien zeigten eindeutige Phänotypen, wie exzessive Wurzelhaarbildung, starke Wachstumsdefekte und reduzierten Samenertrag. Die Phänotypisierung einer Knockout-Mutante steht aber in Widerspruch zu bereits veröffentlichten Ergebnissen (Pandey et al. 2005) und deutet darauf hin, dass die Funktion von ABR1 nicht in der Weise mit ABA-Signalwegen in Verbindung steht, wie zuvor angenommen.
Des Weiteren werden Daten zu möglichen Zielen des Transkriptionsfaktors LBD41 (LOB DOMAIN-CONTAINING PROTEIN 41) präsentiert. LBD41 ist ein Repressor der Transkription und wird bei Hypoxie verstärkt exprimiert. Sein Transkriptlevel wird von ERF-VII Transkriptionsfaktoren reguliert.

Abstract in weiterer Sprache

Arabidopsis thaliana was used in this work to analyze signaling pathways and adaptation mechanisms that influence the tolerance to submergence and hypoxic stress.
The expression of a common set of 49 genes is upregulated by hypoxia in a wide range of different Arabidopsis cell types (Mustroph et al. 2009). A screening of microarray databases for mutants with a differential regulation of these genes lead to the discovery of data of the EMS-mutant ged1 (greening after extended darkness 1, Choy et al. 2008). Ged1 shows a significant upregulation of 36 of these 49 hypoxia-responsive genes under normoxic conditions.
Map based cloning of ged1 revealed a mutation in the gene PRT6 and therefore a new allele of a prt6-mutant in a Wassilewskija background. PRT6 is an ubiquitin ligase, whose function as an essential enzyme for an oxygen sensing mechanism, mediated by the N-end rule pathway, had just been emerging through two independent publications at that time (Gibbs et al. 2011, Licausi et al. 2011).
Ged1 was compared to the T-DNA insertion line prt6-1 in a Col-0 background. Both mutants were more tolerant than their respective wildtypes in submergence experiments.
These results are contradictive to published submergence experiments with prt6-mutants in similar ecotypic backgrounds that demonstrate an intolerance of the mutants (Licausi et al. 2011, Weits et al. 2014). Also the length of survival of all genotypes greatly differs between both experimental setups, i.e. they are up to severalfold shorter in the published experiments.
The reason for this difference could be identified as the humidity during the recovery treatment, revealing a susceptibility of prt6-mutants to an impaired water uptake by the root.
Interestingly, ged1 showed higher Lt50 values when subjected to submergence in darkness compared to air in darkness, which was not observed in the other genotypes.
This finding could be linked to a fourfold higher carbohydrate content including starch, sucrose, glucose and fructose in rosette leaves of ged1 after 24 h of submergence in darkness compared to air treatment. Similar differences in carbohydrate content were measured in prt6-1 although the survival rate of this genotype is lower during submergence in darkness compared to air in darkness.
Remarkably, both mutants showed an about twofold higher carbohydrate content after 24 h of submergence compared to the wildtypes. No differences in carbohydrate content between the genotypes were, however, measured after air treatment, although both prt6-mutants survived longer than their wildtypes in different darkness in air survival experiments and showed delayed leaf senescence.
Hence, the observed reduction in carbohydrate consumption during submergence is triggered by hypoxia or some other submergence derived signals but is enhanced in mutants with an impaired N-end-rule pathway.
These results point to an involvement of a switched-off N-end rule pathway in the downregulation of carbohydrate consumption and economizing with energy sources in spite of a simultaneous upregulation of the expression of several genes with a function in sugar degradation and fermentation.
Furthermore, several phenotypes of N-end rule pathway mutants, namely an abscisic acid hypersensitive arrest of seedling establishment and the ability to survive long periods of darkness could be linked with the activity of subgroup VII ERF transcription factors that are known targets of protein degradation through the N-end-rule pathway.
A new putative target of the N-end rule pathway, the ERF transcription factor ABR1 (ABA REPRESSOR 1) was characterized. Its transcript was found to be highly upregulated by anoxia treatment. Experiments on overexpression lines revealed strong phenotypes like excessive root hair formation, severe growth defects and reduced seed yield. However, phenotyping of a knockout mutant contradicted already published results (Pandey et al. 2005), indicating that the function of ABR1 might not necessarily be involved in abscisic acid signaling as assumed before.
Lastly, some work on putative targets of the transcription factor LBD41 (LOB DOMAIN-CONTAINING PROTEIN 41) is presented. LBD41 is a transcriptional repressor and is highly induced by hypoxic stress. Its transcript abundance is regulated by a subset of subgroup VII ERF transcription factors.