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Synthese von Glycoformen des humanen Erythropoietins

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Seeleithner, Simone:
Synthese von Glycoformen des humanen Erythropoietins.
Bayreuth , 2019 . - 172 p.
( Doctoral thesis, 2019 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)
DOI: https://doi.org/10.15495/EPub_UBT_00004344

Official URL: Volltext

Abstract in another language

Glycoproteine spielen eine wichtige Rolle bei vielen biologischen Prozessen.[13] Da natürlich vorkommende Glycoproteine stets eine Mikroheterogenität aufweisen, aber zur Erforschung von Struktur-Wirkungsbeziehungen homogene Glycoformen vonnöten sind, müssen letztere durch chemische und enzymatische Synthese dargestellt werden.[20,24]
Das Immunoglobulin G1 weist in der Fc-Region ein N-Glycan auf.[171] Das Fc 287-320 Glycopeptidhydrazid 1 wurde durch Fmoc-SPPS und Pseudoprolin-vermittelte Lansbury-Aspartylierung dargestellt. Zur Vermeidung einer Cyclisierung des C-terminalen Lysins wurde eine TFAc-Schutzgruppe eingesetzt, deren Eignung für Ligationen bestätigt wurde.
Erythropoietin regelt durch Stimulation der Erythropoese die Sauerstoffhomöostase im menschlichen Körper.[125] Humanes Erythropoietin besitzt drei N-Glycane, deren Struktur die in vivo-Aktivität maßgeblich beeinflusst.[12,152] Um monoglycosyliertes EPO A durch Semisynthese zu gewinnen, wurde das EPO 1-28 (Nona) Hydrazid 23 durch konvergente Glycopeptidsynthese dargestellt und der Zucker enzymatisch sialyliert. Nach Thioveresterung und anschließender NCL mit dem rekombinanten EPO 29-166 Peptidfragment C lieferte die oxidative Rückfaltung EPO (Undeca) A mit einem α-2,6-sialylierten komplexen N-Glycan an Asn-24 in 33 % Ausbeute.
Die Totalsynthesestrategie für dreifach glycosyliertes EPO D sah die sequentielle NCL der fünf Fragmente B2-H2 mit Entschwefelung von drei Cysteinen vor. Hierfür wurden verschiedene Schutzgruppenstrategien untersucht.
Bei der Trt/Nvoc-Strategie erfolgte der Schutz der nativen Cysteine-29, 33 und 161 durch eine säurelabile Tritylgruppe, die an den entschützten Peptiden nachträglich eingeführt wurde. Das C terminale Lys-97 wurde durch eine Nvoc-Gruppe in der Seitenkette geschützt. Das EPO 29-67 (2xSTrt, Nona) Hydrazid 29 ergab aufgrund der hydrophoben Tritylschutzgruppen niedrige Ausbeuten bei der Retritylierung. Die Synthese des Peptidfragments EPO 98-166 (STrt) 33 erfolgte durch NCL. Das schwer lösliche doppelt glycosylierte EPO 29-97 (2xSTrt, Nvoc) Hydrazid 34 wurde nach Thioveresterung mit 33 verknüpft, wobei die Tritylgruppen die Isolierung von EPO 29-166 (3xSTrt, 2xNona, Nvoc) 36 erschwerten.
Aufgrund der Schwierigkeiten wurde die Acm/TFAc-Strategie zur Darstellung von EPO mit drei komplexen N-Glycanen D angewandt. Das Glycopeptidhydrazid EPO 29-67 40 wurde mit einer Acm-Schutzgruppe an Cys-29 und 33 synthetisiert. Die Labilität der Acm Gruppe bei der palladiumkatalysierten Entschützung der Glycosylierungsstelle wurde durch die Verwendung einer PhiPr-Schutzgruppe umgangen. EPO 68-97 (Nona) F2 wurde mit einem TFAc-geschützten Lys-97 dargestellt. Die α-2,6-Sialylierung der biantennären N Glycane an den Glycopeptidhydraziden 40 und F2 gelang. Nach Umsetzung von 40 zum Thioester E2 erfolgte die Ligation mit F2 zum doppelt glycosylierten EPO 29-97 (2xSAcm, TFAc) 47 und dessen Thioveresterung. An dem Peptid EPO 98-166 (Thz, SPhacm) 51 wurde die Entfernung beider Cys-Schutzgruppen mit PdCl2 getestet. Hierbei wurde eine höhere Labilität von Phacm im Vergleich zu Thz festgestellt. An dem Ligationsprodukt EPO 29 166 (3xSAcm, 2xNona, TFAc) 55 wurden die nicht-nativen Cysteine-68, 98 und 128 zu nativen Alaninen entschwefelt. Die Abspaltung der Acm-Gruppen an den drei verbliebenen Cysteinen mit PdCl2 ergab EPO 29-166 (3xSH, 2xNona, TFAc) 58. Die basische Entfernung der TFAc Gruppe tendiert zu Nebenreaktionen, gelang jedoch schließlich an 58. Der EPO 1 28 (Nona) Thioester B2 und EPO 29-166 (3xSH, 2xNona) 59 wurden zum Volllängenglycoprotein Dred ligiert und zu EPO (3xNona) D oxidativ rückgefaltet.
Da die Abspaltung der TFAc-Schutzgruppe mit zahlreichen Problemen verbunden war, wurde die Synthese von dreifach glycosyliertem EPO D nach der Acm-Strategie weiterverfolgt. Es wurde zunächst die TFAc-Gruppe an Lys-97 des EPO 68-97 (TFAc) Glycopeptidhydrazids F2 entfernt, was sich an dieser Stelle als unproblematisch erwies. Durch Thioveresterung und sequentielle NCL wurde EPO 29-166 (3xSAcm, 2xNona) 62 erhalten. Eine ε-Caprolactam-bildung an Lys-97 trat nicht auf. Nach Entschwefelung und Abspaltung der Acm-Gruppen führten die NCL mit dem EPO 1 28 (Nona) Thioester B2 und die folgende oxidative Rückfaltung zu dem gewünschten dreifach N-glycosylierten EPO D. Die Ausbeute betrug 11 %. Mit der Acm-Strategie wurde somit eine gangbare Vorgehensweise zur Totalsynthese von homogenem dreifach N-glycosylierten EPO etabliert.

Abstract in another language

Glycoproteins play an important role at many biological processes.[13] Since naturally occuring glycoproteins always exhibit microheterogeneity, but for structure-activity relationship studies homogeneous glycoforms are necessary, they need to be assembled by chemical and enzymatic synthesis.[20,24]
Immunoglobulin G1 possesses one N-glycan in the Fc region.[171] The Fc 287-320 glycopeptide hydrazide 1 was assembled by Fmoc-SPPS and pseudoproline-assisted Lansbury aspartylation. A TFAc protective group was used to prevent cyclization of the C-terminal lysine and its applicability for ligations was confirmed.
Erythropoietin regulates the oxygen homoiostasis in the human body by stimulation of erythropoiesis.[125] Human erythropoietin possesses three N-glycans whose structure influences the in vivo activity significantly.[12,152] To obtain monoglycosylated EPO A through semisynthesis the EPO 1 28 (nona) hydrazide 23 was assembled by convergent glycopeptide synthesis and the sugar was sialylated enzymatically. After thioesterification and following ligation with the recombinant EPO 29-166 peptide fragment C oxidative refolding provided EPO (undeca) A with an α-2,6-sialylated complex N-glycan at Asn-24 in 33 % yield.
The total synthesis strategy for triglycosylated EPO D envisaged the sequential NCL of the five fragments B2-H2 with desulfurization of three cysteines. Different protective group strategies were investigated.
Within the Trt/Nvoc strategy protection of the native cysteines-29, 33 and 161 was maintained by an acid labile trityl group, which was introduced afterwards at the deprotected peptides. The C terminal Lys-97 was protected by a Nvoc group in the side chain. EPO 29-67 (2xSTrt, nona) hydrazide 29 gave low yields at retritylation due to the hydrophobic trityl protective groups. The synthesis of the peptide fragment EPO 98-166 (STrt) 33 was carried out by NCL. The poorly soluble biglycosylated EPO 29-97 (2xSTrt, Nvoc) hydrazide 34 was connected to 33 after thioesterification, however, the trityl groups hampered the isolation of EPO 29-166 (3xSTrt, 2xNona, Nvoc) 36.
Due to the difficulties the Acm/TFAc strategy was applied for assembling EPO with three complex N-glycans D. The glycopeptide hydrazide EPO 29-67 40 was synthesized with an Acm protective group at Cys 29 and 33. The lability of the Acm group at palladium catalyzed deprotection of the glycosylation site was circumvented by use of a PhiPr protective group. EPO 68-97 (nona) F2 was assembled with a TFAc protected Lys-97. The α 2,6-sialylation of the biantennary N-glycans at the glycopeptide hydrazides 40 and F2 was successful. After conversion of 40 into the thioester E2 ligation with F2 to biglycosylated EPO 29-97 (2xSAcm, TFAc) 47 and its thioesterification was carried out. At the peptide EPO 98-166 (Thz, SPhacm) 51 removal of both Cys protective groups with PdCl2 was tested. Here a higher lability of Phacm compared to Thz was observed. At the ligation product EPO 29 166 (3xSAcm, 2xnona, TFAc) 55 the non-native cysteines-68, 98 and 128 were desulfurized to native alanines. Removal of the Acm groups of the three remaining cysteines by PdCl2 resulted in EPO 29-166 (3xSH, 2xnona, TFAc) 58. Basic removal of the TFAc group tended to side reactions, but finally succeeded at 58. The EPO 1-28 (nona) thioester B2 and EPO 29 166 (3xSH, 2xnona) 59 were ligated to the full length glycoprotein Dred and oxidatively refolded to EPO (3xnona) D.
Because of numerous problems removing the TFAc protective group the synthesis of triglyco-sylated EPO D was pursued according to the Acm strategy. First of all the TFAc group at Lys-97 of the EPO 68-97 (TFAc) glycopeptide hydrazide F2 was removed, which proved to be non-problematic at this step. By thioesterification and sequential NCL EPO 29 166 (3xSAcm, 2xnona) 62 was obtained. An ε-caprolactam formation at Lys-97 did not occur. After desulfurization and removal of the Acm groups NCL with the EPO 1 28 (nona) thioester B2 and following oxidative refolding lead to the desired tri-N-glycosylated EPO D. The yield accounted for 11 %. Thus, with the Acm strategy a viable procedure for the total synthesis of homogeneous tri N glycosylated EPO was established.

Further data

Item Type: Doctoral thesis
Keywords: EPO; glycoproteins; glycopeptides; N-glycans; peptide synthesis; bioorganic synthesis
Institutions of the University: Faculties > Faculty of Biology, Chemistry and Earth Sciences
Faculties > Faculty of Biology, Chemistry and Earth Sciences > Department of Chemistry
Faculties > Faculty of Biology, Chemistry and Earth Sciences > Department of Chemistry > Chair Bioorganic Chemistry > Chair Bioorganic Chemistry - Univ.-Prof. Dr. Carlo Unverzagt
Graduate Schools > Bayreuth Graduate School of Mathematical and Natural Sciences (BayNAT)
Faculties
Faculties > Faculty of Biology, Chemistry and Earth Sciences > Department of Chemistry > Chair Bioorganic Chemistry
Graduate Schools
Result of work at the UBT: Yes
DDC Subjects: 500 Science > 540 Chemistry
Date Deposited: 11 May 2019 21:00
Last Modified: 11 May 2019 21:00
URI: https://eref.uni-bayreuth.de/id/eprint/48931