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Zwiener, Theresa:
Towards a ‘chassis’ for magnetosome biosynthesis : large-scale genome engineering in the magnetic bacterium Magnetospirillum gryphiswaldense.
Bayreuth
,
2023
. - VIII, 159 S.
(
Dissertation,
2023
, Universität Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT)
DOI: https://doi.org/10.15495/EPub_UBT_00007185
Volltext
Abstract
Magnetotactic bacteria biosynthesize specific organelles, so-called magnetosomes, which are membrane-enclosed magnetic iron minerals that enable the cells to align along geomagnetic field lines. The magnetic bacterium Magnetospirillum gryphiswaldense has emerged as model organism for the analysis of magnetosome biosynthesis and bioproduction. In M. gryphiswaldense, the genomic magnetosome island (MAI) encodes all genetic determinants required for this intricate biosynthesis process, but harbours also numerous mobile genetic elements, repeats and genetic ‘junk’. The boundaries of the MAI and the role of its intervening and adjacent regions regarding their relevance for magnetosome biosynthesis and growth under lab conditions are still unclear. Because of the inherent genetic instability of the magnetosome biosynthesis gene clusters, the elimination of intervening and adjacent gene content and the substitution of the native MAI by a compact magnetosome expression cassette is highly desirable. In addition, recent observations suggested the involvement of further auxiliary determinants for magnetosome biosynthesis encoded outside the MAI, which however, have not yet been identified. Furthermore, the future use of M. gryphiswaldense will require techniques for large-scale genome editing.
In this thesis, first, new putative auxiliary determinants outside the MAI supporting the complex magnetosome formation process were verified by targeted deletion. Second, an allelic replacement method based on homologous recombination was validated and optimized for large-scale genome mutagenesis up to at least ~100 kb. Thereby, new boundaries of the MAI were defined, and a large region with no function in magnetosome biosynthesis spanning ~73 kb could be eliminated and replaced by a compact and contiguous ~38 kb cassette comprising solely the essential biosynthetic gene clusters, but devoid of irrelevant or problematic gene content. This technique was further used to identify and eliminate problematic gene content including putative prophages, active mobile genetic elements, and irrelevant gene clusters outside the MAI.
Ultimately, combinatory deletions including large regions, active mobile genetic elements, and phage-related genes were combined in a nearly 5.5% genome-reduced strain, thereby providing the first proof-of-principle for large-scale engineering of magnetotactic bacteria.
Altogether, the results of this thesis will be useful for future genome manipulations to generate prospective chassis strains for improved magnetosome engineering and enhanced stable high-yield magnetosome production in M. gryphiswaldense.
Abstract in weiterer Sprache
Magnetotaktische Bakterien besitzen die Fähigkeit spezielle Organellen, sogenannte Magnetosomen, zu synthetisieren. Das Magnetbakterium Magnetospirillum gryphiswaldense stellt dabei einen Modellorganismus für die Analyse der Magnetosomen-Biosynthese und -Bioproduktion dar. Die für die Kontrolle der Magnetosomen-Biosynthese relevanten Gene sind in M. gryphiswaldense in einer genomischen Magnetosomeninsel (MAI) lokalisiert. Letztere kodiert ebenfalls eine Vielzahl mobiler genetischer Elemente, repeats, sowie ‘genetic junk’. Die Grenzen der MAI als auch die Funktionen der Regionen zwischen den Magnetosomen-Operons sowie angrenzender Regionen sind hinsichtlich ihrer Relevanz für die Magnetosomen-Biosynthese und das zelluläre Wachstum unter Laborbedingungen noch weitestgehend unerforscht. Aufgrund der genetischen Instabilität der Magnetosomen-Cluster wäre die Deletion der Regionen zwischen den Operons als auch der Austausch der nativen MAI durch eine kompakte Kassette, welche alle Magnetosomen-Gene enthält, von großem Interesse und für zukünftige genetische Manipulationen in M. gryphiswaldense und anderen Magnetbakterien von großer Bedeutung. Neueste Forschungsergebnisse sprechen außerdem dafür, dass am komplexen Ablauf der Magnetosomen-Biosynthese weitere unterstützende Faktoren außerhalb der MAI beteiligt sein könnten. Zudem erfordert die zukünftige genetische Manipulation in M. gryphiswaldense und anderen Magnetbakterien passende Methoden für ausgedehntere genetische Manipulationen.
In der vorliegenden Arbeit wurden neue Kandidaten-Gene außerhalb der MAI, welche an der Magnetosomen-Biosynthese beteiligt sind, durch gezielte Deletion verifiziert. Des Weiteren konnte eine Technik basierend auf homologer Rekombination für die großflächige genetische Manipulation von bis zu ~100 kb validiert werden. Dabei konnten neue Grenzbereiche der MAI für mögliche Deletionen definiert und eine Region irrelevant für die Funktion in der Magnetosomen-Biosynthese mit einem Ausmaß von ~73 kb durch eine kompakte Kassette, die alle Magnetosomen-Gene enthält, ersetzt werden. Dieselbe Methode wurde schließlich dazu verwendet, um weiteren problematischen Geninhalt wie potentielle Prophagen und aktive mobile genetische Elemente außerhalb der MAI zu identifizieren und eliminieren.
Letztlich konnte durch kombinatorische Genomreduktion ausgedehnter Regionen, vermeintlicher Prophagen und aktiver mobiler genetische Elemente ein bis zu 5,5% genom-reduzierter Stamm konstruiert, sowie die Machbarkeit (proof-of-principle) zur genetischen Optimierung magnetotaktischer Bakterien erbracht werden.
Insgesamt bilden die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit die Grundlage für die zukünftige Konstruktion eines angehenden chassis, um die genetische Manipulation der Magnetosomen zu verbessern sowie stabile und hohe Magnetosomen-Erträge aus M. gryphiswaldense zu erzeugen.