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Chemoenzymatische Synthese unsymmetrischer N-Glycanazide

Title data

Spies, Carolina:
Chemoenzymatische Synthese unsymmetrischer N-Glycanazide.
Bayreuth , 2023 . - V, 186 p.
( Doctoral thesis, 2023 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)
DOI: https://doi.org/10.15495/EPub_UBT_00007351

Official URL: Volltext

Abstract in another language

Glycosylierungen gehören zu den wichtigsten posttranslationalen Modifikationen von Proteinen und tragen maßgeblich zu deren Eigenschaften und Stabilität bei. Für die Analyse der Funktion von Glycanen auf Glycoproteinen ist es essentiell Zugang zu reinen Glycanen zu haben. Die Mikroheterogenität der N-Glycane erschwert zwar deren Isolation aus natürlichen Quellen, jedoch kann das Sialoglycopeptid 5 in guten Ausbeuten aus Hühnereigelb extrahiert werden. Dieses kann wiederum durch chemische und enzymatische Modifikationen zu dem Nonasaccharidazid 25 umgesetzt werden.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden Methoden etabliert, um ausgehend von dem Nonasaccharid 25 eine Bibliothek unterschiedlicher unsymmetrischer N-Glycane darzustellen. 25 konnte durch unvollständige Sialylierungen mit einer alpha-2,6-Sialyltransferase aus Photobacterium damselae und einer alpha-2,3-Sialyltransferase aus Vibrio species zu den monosialylierten N-Glycanen 35, 36, 37 und 38 umgesetzt werden. Die Ausbeuten der Monosialylierungen lagen nach HPLC-Reinigung bei 27 bis 42 %. Die monosialylierten Glycane wurden im Anschluss mit einer beta-Galactosidase aus Aspergillus oryzae zu den Glycanen 40, 41, 42 und 43 umgesetzt. Hierbei konnten nach Reinigung über RP-HPLC Ausbeuten von 77 bis 99 % erreicht werden. Die beiden monogalactosylierten N-Glycane 26 und 27 wurden aus 40 und 41 durch Behandlung mit Neuraminidase aus Clostridium perfingens gewonnen.
Zusätzlich zu diesen unsymmetrischen N-Glycanen konnten auch deren core-fucosylierte Analoga dargestellt werden. Als Ausgangsverbindung hierfür wurde das aus 25 zugängliche Decasaccharid 20 verwendet. Die Glycane 44, 45, 46 und 47 wurden durch unvollständige Sialylierung in Ausbeuten von 39 bis 54 % erhalten. Eine Behandlung mit beta-Galactosidase ergab die Glycane 48, 49, 50 und 51 in Ausbeuten von 80 bis 90 %. Die monogalactosylierten Glycane 52 und 53 wurden in Ausbeuten von je 87 % erhalten.
Aus biantennären unsymmetrischen N-Glycanen konnten triantennären Glycane erhalten werden. Dies gelang durch Umsetzung der monosialylierten Glycane 40 und 42 mit der N-Acetylglucosamintransferase GnT IVa. Die beiden triantennären Glycane 63 und 65 wurden in Ausbeuten von je 63 % erhalten. Durch Umsetzungvon 41 und 43 mit GnT V wurden 64 und 66 in Ausbeuten von 62 bis 68 % erhalten. Weiterhin wurden drei der triantennären N-Glycane mit beta-1,4-Galactosyltransferase (GalT1) galactosyliert. So konnten die selektiv monosialylierten Glycane 73, 75 und 74 in Ausbeuten von 7 bis 37 % erhalten werden. Somit gelang es im Rahmen dieser Arbeit eine umfangreiche Bibliothek unsymmetrischer bi- und triantennärer N-Glycane aufzubauen und deren Darstellung und Reinigung zu optimieren. Diese steht nun für weitere Modifikationen und Verwendung auf Glycanarrays zur Verfügung.

Abstract in another language

Glycosylation is one of the most important posttranslational modifications of proteins and contributes significantly to their properties and stability. It is essential for the analysis of the function of glycoproteins to have access to pure glycans. The microheterogenity of N-glycans complicates direct isolation of glycans from natural sources, however the sialoglycopeptide 5 can be extracted from egg yolk in high yields. This can be converted to the nonasaccharide 25 by enzymatic modifications.
In this thesis, methods to synthesize a library of different asymmetric N-glycans from nonasaccharide 25 were established. Nona could be converted to the monosialylated glycans 35, 36, 37 and 38 by monosialylation with a alpha-2,6-sialyltransferase from Photobacterium damselae and a alpha-2,3-sialyltransferase from Vibrio species. Yields of the monosialylation after purification by HPLC ranged between 27 and 42 %. The monosialylated glycans could be converted to the glycans 40, 41, 42 and 43 using a beta-galactosidase from Aspergillus oryzae. After HPLC yields between 77 and 99 % could be obtained. Then the two monogalactosylated N-glycans 26 and 27 could be obtained from 40 and 41 by treatment with neuraminidase from Clostridium perfingens. After HPLC the yields ranged between 85 and 87 %.
In addition to these asymmetric N-glycans their core-fucosylated analogues could be synthesized. Starting material was the decasaccharide 20, which is accessible from 25. The glycans 44, 45, 46 and 47 could be obtained by incomplete sialylation in yields between 39 and 54 %. By treatment with beta-galactosidase, the glycans 48, 49, 50 and 51 could be obtained in yields between 80 and 90 %. The monogalactosylated glycans 52 and 53 could be obtained in a yield of 87 %.
In addition to the biantennary asymmetric N-glycans a series of triantennary glycans could be synthesized. Therefore, the monogalactosylated and monosialylated glycans 40 and 42 were elongated by the N-acetylglucosamintransferase GnT IVa. After HPLC the triantennary glycans 63 and 65 could be obtained in a yield of 63 %. 64 and 66 could be obtained by reaction with GnT V in a yield between 62 to 68 %. Finally, three of the triantennary N-glycans were
galactosylated completely by a beta-1,4-galactosyltransferase (GalT1). Thus, the glycans 73, 75 and 74 could be obtained in yields between 7 and 37 %.
Therefore, in this thesis, an extensive library of asymmetric bi- and triantennary N-glycans was successfully synthesized and their purification was optimized. These glycans are now available for further modification and use in glycan arrays.

Further data

Item Type: Doctoral thesis
Keywords: N-Glycane; Sialylierung; Galactosylierung
Institutions of the University: Faculties > Faculty of Biology, Chemistry and Earth Sciences > Department of Chemistry
Faculties > Faculty of Biology, Chemistry and Earth Sciences > Department of Chemistry > Chair Bioorganic Chemistry > Chair Bioorganic Chemistry - Univ.-Prof. Dr. Carlo Unverzagt
Graduate Schools > University of Bayreuth Graduate School
Faculties
Faculties > Faculty of Biology, Chemistry and Earth Sciences
Faculties > Faculty of Biology, Chemistry and Earth Sciences > Department of Chemistry > Chair Bioorganic Chemistry
Graduate Schools
Result of work at the UBT: Yes
DDC Subjects: 500 Science > 540 Chemistry
Date Deposited: 16 Dec 2023 22:00
Last Modified: 16 Dec 2023 22:00
URI: https://eref.uni-bayreuth.de/id/eprint/88062