Selection and characterization of D-enantiomeric peptides for the investigation of options for therapy and diagnosis of Alzheimer’s disease

Titelangaben

Malhis, Marwa:
Selection and characterization of D-enantiomeric peptides for the investigation of options for therapy and diagnosis of Alzheimer’s disease.
Bayreuth , 2021 . - XI,103 S.
( Dissertation, 2021 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)
DOI: https://doi.org/10.15495/EPub_UBT_00005726

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Abstract

Morbus Alzheimer (AD) is a neurodegenerative disease, characterized by steady loss of cognitive functions, behavioral changes and neuropsychological symptoms. Today, AD can be treated only symptomatically. There is no drug available, which stops or reverses the pathological changes in AD. Alzheimer's disease is characterized by two pathological hallmarks, amyloid plaques and neurofibrillary tangles (NFTs). NFTs are composed of aggregated tau protein. The accumulation of tau into NFTs reduces normal tau function and causes neuronal dysfunction. The formation of tau aggregates is triggered by two hexapeptide sequences within tau: VQIINK (PHF6*), which is located at the beginning of the second repeat (R2) and VQIVYK (PHF6), which is located at the beginning of the third repeat (R3). PHF6* segment has recently been described as a more potent driver of tau aggregation than PHF6.
Peptides that inhibit the pathological aggregation of tau are potentially useful candidates for future therapies in AD. The use of the molecular biology screening technique, phage display, allows fast and simple selection of peptides that bind to a desired target protein.
The aim of this study was to develop specific D-enantiomeric peptides that inhibit the pathological aggregation of tau. D-enantiomeric peptides were chosen as they are protease stable and considerably less immunogenic than L-peptides.
Another objective of this project was to investigate which of the both sequences within tau, PHF6 or PHF6*, is the more effective target for the development of tau aggregation inhibiting peptides.
Employing phage display and mirror image phage display, we selected specific peptides to inhibit tau fibril formation. Two selections were performed; the first selection was conducted using monomers of L-enantiomeric full-length tau as a target for phage display. In addition, we performed a second selection using fibrils of the D-enantiomeric hexapeptide VQIINK (PHF6*) as a target for mirror image phage display. PHF6* segment was targeted in our second selection since PHF6* was recently reported as a more powerful driver for tau aggregation as PHF6.
The most interesting obtained peptide, designated MMD3, was found both in the selection against tau monomer and in the selection against D-PHF6* fibrils. MMD3 and its retro-inverso form, designated MMD3rev, clearly inhibited PHF6* aggregation as well as full-length tau aggregation in Thioflavin T (THT) assays.
In addition, we performed preliminary experiments to investigate which of the both sequences, PHF6 or PHF6*, is the more effective target for inhibitors of tau fibril formation. We compared the tau aggregation inhibiting effects of MMD3 and MMD3rev with other peptides, which were previously described in the literature and target either PHF6 or PHF6*, respectively. From our early preliminary data, it seems likely that PHF6 and PHF6* aggregation inhibitors are comparably effective in inhibiting the aggregation of full-length tau. However, further characterization using different biochemical and biophysical methods is still required.
Our selected peptides MMD3 and MMD3rev present promising candidates for therapeutic and diagnostic applications in AD research. Currently, MMD3 and MMD3rev are further characterized in the German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE).

Abstract in weiterer Sprache

Die Alzheimer-Demenz (AD), lateinisch Morbus Alzheimer, ist eine neurodegenerative Erkrankung, die durch die fortschreitende Abnahme kognitiver Funktionen gekennzeichnet ist und mit Verhaltensstörungen und neuropsychologischen Symptomen assoziiert. Bis heute ist die Behandlung von AD nur symptomatisch. Trotz der bisherigen Forschungsanstrengungen ist kein kausales Medikament zugelassen, welches den Krankheitsverlauf aufgehalten oder rückgängig machen kann.
Die Hauptmerkmale der AD sind die Entstehung von amyloiden Plaques und das Auftreten von neurofibrilliären Bündeln. Neurofibrilliäre Bündel bestehen hauptsächlich aus aggregierten Tau-Proteinen. Tau-Protein-Aggregation führt zu einem Verlust der Tau-Funktion (etwa der Stabilisierung der Mikrotubuli) sowie zu Neurotoxizität und Zelldegeneration. Die Bildung amyloider Tau-Aggregate wird innerhalb von Tau durch zwei aus sechs Aminosäuren bestehenden Fragmente angetrieben: i) VQIINK (PHF6*), zu Beginn von Repeat 2 gelegen, und ii) VQIVYK (PHF6), zu Beginn von Repeat 3 gelegen. Es wurde kürzlich beschrieben, dass das PHF6*-Segment die pathologische Tau-Aggregation stärker antreibt als das PHF6-Fragment.
Peptide, die die Tau-Aggregation inhibieren, sind mögliche Kandidaten für zukünftige Therapien bei Alzheimer. Zur Selektion affiner Peptide für spezielle Bindepartner ist die molekularbiologische Methode des Phagendisplays eine einfache und schnelle Möglichkeit.
Ziel dieser Arbeit war es, D-enantiomere Peptide zu entwickeln, die die pathologische
Aggregation des Tau-Proteins hemmen können. D-Peptide können L-Peptiden für Anwendungen in vivo überlegen sein, da sie proteaseresistent sind und in der Regel das Immunsystem nicht aktivieren.
Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es herauszufinden, welches der beiden Tau Fragmente, PHF6 oder PHF6*, das bedeutsamere therapeutische Target für die Entwicklung von Tau-Aggregations-inhibierenden Peptiden ist.
Mittels Phagendisplay und Spiegelbild-Phagendisplay konnten D-Peptide entwickelt werden, die die Formation von Tau-Fibrillen inhibierten. Zwei Selektionen wurden durchgeführt: die erste Selektion wurde gegen Tau-Monomer mittels Phagendisplay durchgeführt; die zweite Selektion wurde gegen D-Enantiomere PHF6*-Fibrillen mittels Spiegelbild-Phagendisplay durchgeführt. PHF6*-fibrillen wurden in der zweiten Selektion adressiert, da eine aktuelle Studie zeigte, dass die PHF6*-Sequenz die Aggregation des Tau-Proteins stärker antreibt als die PHF6-Sequenz.

Das besonders vielversprechende Peptid MMD3 wurde sowohl in der Selektion gegen Tau-Monomer als auch in der Selektion gegen D-Enantiomere PHF6*-Fibrillen identifiziert. Es konnte per Thioflavin-Assay bestätigt werden, dass MMD3 und seine retro-inverse Version MMD3rev sowohl die Aggregation von PHF6* als auch die Fibrillenbildung des Volllänge-Tau-Proteins inhibierten.
In einem ersten Ansatz zur Untersuchung, welches der beiden Hexapeptide innerhalb von Tau, PHF6 oder PHF6*, das effektivere Ziel zur Aggregations-Inhibition ist, wurde die inhibitorische Wirkung von MMD3 und MMD3rev (gerichtet gegen PHF6*) mit den bereits beschriebenen Peptiden, die gegen PHF6 bzw. PHF6* gerichtet sind, verglichen. Dieses erste vorläufige Ergebnis zeigte, dass gegen PHF6 bzw. gegen PHF6*-gerichtete Peptide ähnlich wirksam in ihren aggregationsinhibierenden Eigenschaften sind. Allerdings steht hier eine weitere Charakterisierung mit verschiedenen biochemischen und biophysikalischen Methoden noch aus.
Die in dieser Arbeit identifizierten D-Peptide MMD3 und MMD3rev sind vielversprechende Kandidaten für einen neuen medikamentösen Ansatz der Behandlung der Alzheimer-Demenz und werden aktuell bei einem Kooperationspartner vom Deutschen Zentrum für Neurodegenerative Erkrankungen (DZNE) weiter charakterisiert.