Die Bedeutung von endogenem und künstlichem Auxin für die Kultivierung photoautotropher Zellen von Chenopodium rubrum

Titelangaben

Valdes, Oscar:
Die Bedeutung von endogenem und künstlichem Auxin für die Kultivierung photoautotropher Zellen von Chenopodium rubrum.
Bayreuth , 2005
( Dissertation, 2005 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Das Ziel dieser Arbeit war die Klärung der Bedeutung von endogenem (IES) und künstlichem Auxin (2,4-D) für das Wachstum der photoautotrophen Chenopodium rubrum-Zellkultur. Das Cytokininspektrum dieser Zellen und die Ethylenproduktion einer Suspensions-Batchkultur war bereits über den ganzen Verlauf von ca. 100 Tagen eingehend untersucht worden, über die endogenen Auxinverhältnisse lagen jedoch keine Daten vor. Die Quantifizierung der IES-Konzentration erfolgte dann mit Hilfe des ELISA nach Weiler (1986). Mit der optimierten Methode wurde der Auxingehalt während der gesamten Kulturperiode gemessen. Zu Beginn der Kultur (4.Tag) durchläuft die endogene Konzentration an IES einen kurzzeitigen, aber besonders ausgeprägten Peak, wobei die Konzentration bereits in der Teilungsphase wieder auf einen niedrigen Wert abfällt. In der stationären Phase nimmt die Auxinkonzentration vorübergehend, aber längst nicht so stark wie am Anfang, zu, fällt zum Beginn der Seneszenz wieder ab, und steigt dann in der Schlussphase erneut deutlich an. Der endogene Auxingehalt steht aber auch unter dem Einfluss von exogen angebotenen 2,4-D (Dichlorphenoxyessigsäure). Um einen Beitrag zum Verständnis der Auxinwirkung auf molekularer Ebene zu leisten, wurde zunächst die Aufnahme von exogenem Auxin in die Zellen untersucht. Die Zellen nehmen Auxin sehr schnell und (fast) vollständig aus dem Medium auf. Nun konnte mit Hilfe des Differential Display-Verfahrens gezielt nach Genen gesucht werden, die durch IES induziert werden. Mit diesem Verfahren wurden 3 Genfragmente aufgefunden, deren Expression durch IES induziert wurde. Durch Screenen von cDNA-Banken von Chenopodium rubrum wurden die zugehörigen Gene gefunden: 18R10 (cDNA-Bank aus 35 Tage alten Zellen), A1.1 und Alt6m4 (cDNA-Bank aus 35 Tage alten Zellen nach 2stündiger IES-Behandlung). Das Gen A1.1 wird durch IES, nicht aber durch 2,4-D induziert. Es handelt sich um ein Gencluster, das zwei Proteine codiert - das ribosomale Protein S2 (RPS2) und die Untereinheit IV der ATPase. Im Northern-Blot-Verfahren wurde eine mRNA aus Chenopodium rubrum-Kulturzellen detektiert, die mit der die ATPase-Untereinheit codierenden cDNA aus A1.1 hybridisierte. Da diese mRNA durch die Bindung an eine Oligo-dT-Säule isoliert wurde, muß sie einen Poly-A-Schwanz besitzen und somit aus der Transkription des Kerngenoms stammen, da plastidische mRNA keinen Poly-A-Schwanz aufweist. Ein die ATPase-Untereinheit-codierendes Gen sollte daher auch im Kern der Chenopodium rubrum-Zellen vorkommen, das grosse Ähnlichkeit mit dem entsprechenden cDNA-Bereich des plastomischen A1.1 hat. Die Bildung dieser mRNA wurde duch IES-Behandlung induziert. Daher ist es sehr wahrscheinlich, dass nicht nur die Chloroplasten, sondern auch der Kern der Chenopodium rubrum-Zellen ein ATPase-Untereinheit-codierendes Gen besitzt, dessen Expression durch Auxin induziert werden kann. Das Gen 18R10 codiert eine Lipase mit dem für Phospholipasen typischen GDSL-Motiv. Die Sequenz ist 368 Aminosäuren lang. Eine Hydrophobizitätsindex-Analyse mit Hilfe des TMHMM-Programms ergab, dass die GDSL-Lipase von Chenopodium rubrum ein transmembranes Protein ist. Dabei befindet sich der N-Terminus (12 Aminosäuren) im Zellinneren und ist über einen transmembranen Anker von 19 Aminosäuren an die Zellmembran gebunden. Der größte Teil des Proteins ist extrazellulär (Aminosäuren 32-368), darunter auch das aktive Zentrum. Interessanterweise wurde die Expression dieser Lipase durch IES induziert, aber durch Cytokinin gehemmt. Ein Antagonismus beider Phytohormone wurde auf Genexpressionsebene bisher noch für kein anderes Gen beschrieben. Das Gen Alt6m4 wird nicht in Zellen der Teilungsphase (7 Tage), sondern nur in Zellen der stationären Phase (35 Tage) exprimiert und seine Expression wird durch IES, nicht aber durch 2,4-D induziert. Die Sequenz ist 2692 bp lang, mit einem offenen Leseraster zwischen den Basenpaaren 59-2362. Das entsprechende Protein ist eine ß-Xylo-Glucosidase, die zur Glycosyl-Hydrolase-Familie 3 gehört und 767 Aminosäuren enthält. Um die zellphysiologische Bedeutung dieses Gens zu ermitteln, wurde eine knock-down-transformante (RNAi) Zelllinie hergestellt. Dafür musste ein Transformations- und Selektionssystem für die Chenopodium rubrum-Suspensionskultur entwickelt werden. Die stabile Transformation gelang schließlich durch Partikelbeschuss und Selektion mit Kanamycin. Die Transformante konnte über eine Kalluskultur wieder als Suspensionskultur etabliert werden. Sie wächst erheblich schlechter als der „Wildtyp“ und auch als die Null-Transformante und altert schneller. Die Teilungsfähigkeit dieser Zellen geht schon am 50.Tag der Kultur verloren. Diese Beobachtung ist in Übereinstimmung mit dem Befund, dass das Gen im „Wildtyp“ in der stationären Phase (Tag 30 – 60) am stärksten exprimiert wird.

Abstract in weiterer Sprache

The goal of the present study was to clarify the importance of endogenous (IAA) and synthetic auxin (2,4-D) for the growth of a photoautotrophic cell culture of Chenopodium rubrum. The cytokinin spectrum of these cells had already been thoroughly investigated, as well as the ethylene production during the entire progression of a suspension batch culture over a period of about 100 days. However, no information was available as to the endogenous auxin relations of the cells. Quantification of the IAA concentrations was performed with the aid of the ELISA according to Weiler (1986). The auxin content was measured with the optimized method during the entire culture period. The endogenous IAA concentration exhibits a short-lived, but particularly pronounced peak at the beginning of the culture (4th day), and falls off to a low value already during the division phase. The auxin concentration increased temporarily during the stationary phase, but to a much lesser extent than at the onset of the culture. It decreased again during the onset of senescence, and increased markedly once more during the final phase. The endogenous auxin concentration is, moreover, also influenced by exogenously supplied dichlorophenoxy acetic acid (2,4-D). In order to contribute to the understanding of the effect of auxin at the molecular level, the uptake of exogenous auxin into the cells was studied first. The cells take up auxin very rapidly and (almost) completely from the medium. The differential display technique was then employed to search for genes which were induced by IAA. Three gene fragments whose expression was induced by IAA were found by this procedure. The corresponding genes were found by screening cDNA libraries from Chenopodium rubrum: 18R10 (cDNA library from 35 days old cells), A1.1 and Alt6m4 (cDNA library from 35 days old cells after two hours of treatment with IAA). The gene A1.1 is induced by IAA, but not by 2,4-D. It is actually a gene cluster that encodes two proteins - the ribosomal protein S2 (RPS2) and the subunit IV of an ATPase. A mRNA from Chenopodium rubrum culture cells which hybridized with the cDNA of A1.1 encoding the ATPase subunit was detected by Northern blotting. Since this mRNA was isolated via binding to an oligo dT-column, it must possess a poly-A tail and thus originate from transcription of the nuclear genome, as plastidic mRNA does not have a poly-A tail. A gene encoding an ATPase subunit should thus be present in the nuclear genome of the Chenopodium rubrum cells which is highly similar to the corresponding cDNA region of the plastomic A1.1. The formation of this mRNA is induced by treatment with IAA. It is therefore very probable that not only the chloroplasts, but also the nuclear chromosomes of the Chenopodium rubrum cells possess a gene encoding an ATPase subunit whose expression can be induced by auxin. The gene 18R10 encodes a lipase with the GDSL motif typical of phospholipases. The sequence is 368 amino acids long. An hydrophobicity index analysis with the aid of the TMHMM program showed that the GDSL-lipase from Chenopodium rubrum is a transmembrane protein. The N-terminus (12 amino acids) is within the interior of the cell and is bound to the cell membrane by a 19 amino acid long transmembrane anchor. The largest part of the protein is extracellular (amino acids 28-368), including also the active center. Interestingly, the expression of this lipase is induced by IAA, but inhibited by cytokinin. An antagonism of the two phytohormones on the level of gene expression has not yet been described for any other gene. The gene Alt6m4 is not expressed in young cells of the division phase (7 days), but only in cells in the stationary phase (35 days), and the expression is induced by IAA, but not by 2,4-D. The sequence is 2692 bp long, with an open reading frame between the base pairs 59-2362. The corresponding protein is a ß-xyloglucosidase which belongs to the glycosyl hydrolase family 3 and consists of 767 amino acids. A knock-down transformant (RNAi) cell line was established to determine the cell physiological significance of this gene. This required the establishment of a transformation and selection system for the Chenopodium rubrum suspension culture. Stable transformation was attained by particle bombardment and selection with kanamycin. The transformant was re-established as a suspension culture via a callus culture. The culture grows considerably more slowly than the "wild-type" and than the control transformant and ages more rapidly. The ability of these cells to divide is already gone after 50 days of culture. This observation agrees with the finding that the gene in the "wild type" is expressed most strongly during the stationary phase (days 30-60).