Development of broadly applicable transgenic tools for the transposon mutagenesis of the red flour beetle, Tribolium castaneum

Titelangaben

Viktorinová, Ivana:
Development of broadly applicable transgenic tools for the transposon mutagenesis of the red flour beetle, Tribolium castaneum.
Bayreuth , 2005
( Dissertation, 2005 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

The discovery of non-species-specific, broad-range transposable elements and the establishment of a universal 3xP3 promoter revolutionized insect transgenesis. It overcame the limitations of the germ-line transformation to be restricted to the model organism Drosophila melanogaster. In combination with discernable fluorescent markers, multi-component systems, such as transposon-based insertional mutagenesis, can now be introduced to various insect species. To drive the transposase gene for transposable element remobilisation, suitable promoters are needed. The broadly conserved thermotolerance factor, Hsp70, is well-characterised in D. melanogaster and its promoter, which is inducible by high temperatures, provides a genetic tool for transient gene activation. In this thesis, I could prove that the D. melanogaster hsp70 promoter is functional in Tribolium castaneum as well. Its observed basal level activity, however, must be considered and limits its use for experiments, where no strict transient gene expression is required. Nevertheless, the D. melanogaster hsp70 promoter will suffice to provide an efficient transposase source in transposon-based mutagenesis screens in T. castaneum. The remobilization of non-autonomous transposable elements in such screens results in novel mutations and tagging of potentially interesting cis-regulatory elements. To further investigate gene functions, misexpression studies are necessary. In D. melanogaster, this can be done by directed binary expression systems. Here I could show, that the combination of Gal4delta/UAST works best in D. melanogaster somatic tissue, whereas the LexA/(LL)4 and the tetracycline-controlled systems seem to function only poorly. All constructs are based on broad range transposons as well as universal markers and promoters, so that they can be used in other insect species to determine the best system. Preliminary tests in T. castaneum, however, showed that there are a number of additional problems that need to be addressed, before a suitable binary expression system can be established for this species. The full genome sequence of T. castaneum is now available. Therefore, interesting mutations, cis-regulatory elements and their biological functions can be directly linked to the sequence level. When target sites of site-specific recombination systems are included in insertional mutagenesis screens, their insertion sites can be precisely identified and designed chromosomal rearrangements (inversions, duplications and deletions) created. Here I could present a universal system, which can be introduced into non-drosophilid species and enables such chromosomal rearrangements, which I could successfully demonstrate in D. melanogaster. Defined inversions suppressed meiotic recombination between inverted and non-inverted regions on homologous chromosomes and can thus serve as defined balancer chromosomes. Also defined deletions/duplications were generated in D. melanogaster. Such aberrations will be crucial in other insect species, like T. castaneum, to safely keep mutation stocks and identify gene functions. Moreover, the separation of terminal inverted repeats by inverting the chromosomal region between two transposable elements resulted in immobilization. This is of a particular interest for applied transgenesis approaches in insect pest management, when transgenic insects will be released into the nature and transposable elements must be efficiently protected from potential cross mobilization in host species.

Abstract in weiterer Sprache

Die Entdeckung nicht-speziesspezifischer Transposons mit breitem Wirtsspektrum und die Etablierung des artifiziellen Promotors 3xP3 revolutionierte die Möglichkeiten zur Transgenese von Insekten. Damit konnte die Begrenzung der Keimbahntransformation auf die Taufliege Drosophila melanogaster überwunden werden. In Kombination mit unterscheidbaren, fluoreszierenden Markern können nun Multikomponentensysteme, wie die Transposon basierte Insertionsmutagenese, in verschiedene Insektenarten eingeführt werden. Um das Tranposasegen für die Remobilisierung von nicht-autonomen Transposons zu exprimieren, werden geeignete Promotoren benötigt. Der phylogenetisch konservierte Thermotoleranzfaktor HSP70 ist in D. melanogaster gut untersucht, und der zugehörige Promotor, der bei hohen Temperaturen aktiviert wird, bietet ein genetisches Werkzeug für die konditionelle Genexpression. In dieser Arbeit konnte ich nachweisen, dass der D. melanogaster hsp70 Promotor auch im Mehlkäfer Tribolium castaneum funktioniert. Die beobachtete basale Aktivität des Promotors muss jedoch in Betracht gezogen werden und beschränkt dessen Verwendung für Experimente, bei denen die basale Aktivität nicht stört. Dennoch eignet sich der D. melanogaster hsp70 Promotor für die Expression von Transposasegenen bei der Transposon basierten Mutagenese von T. castaneum. Die Remobilisierung von nicht-autonomen transponierbaren Elementen in solchen Durchmusterungsexperimenten führt zu neuen Mutationen und dem Aufspüren von interessanten cis-regulatorischen Elementen. Um Genfunktionen weiter zu untersuchen, benötigt man die Möglichkeit von Missexpressionsstudien. In D. melanogaster können dafür gesteuerte binäre Expressionssysteme herangezogen werden. Hier konnte ich zeigen, dass in solchen Systemen die Kombination von Gal4delta/UAST im somatischen Gewebe am besten funktioniert, während LexA/(LL)4 und die Tetracyclin kontrollierten Systeme nur schwach zu funktionieren scheinen. Alle verwendeten Konstrukte basieren auf Transposons mit weitem Wirtsspektrum, sowie universellen Markern und Promotoren, so dass sie leicht auf andere Insektenarten übertragen werden können, um auch dort die besten Systeme bestimmen zu können. Erste Untersuchungen in T. castaneum haben jedoch gezeigt, dass es eine Anzahl weiterer Probleme gibt, die angegangen werden müssen, bevor geeignete binäre Expressionssysteme in dieser Spezies zum Einsatz kommen können. Seit Anfang dieses Jahres steht die vollständige Genomsequenz von T. castaneum zur Verfügung. Daher können interessante Mutationen oder cis-regulatorische Elementen und ihre biologischen Funktionen direkt mit der Gensequenz in Verbindung gebracht werden. Wenn mittels Insertionsmutagenese ortspezifische Rekombinaseschnittstellen im Genom verteilt werden, können die Insertionsstellen präzise identifiziert und definierte Rekombinationen (Inversionen, Duplikationen, Deletionen) hergestellt werden. In dieser Arbeit konnte ich ein universelles System beschreiben, dass auch in andere nicht-drosophilide Arten eingeführt werden kann, um entsprechende Umstrukturierungen von Chromosomen vornehmen zu können. Die Vorgehensweise konnte ich in D. melanogaster erfolgreich demonstrieren. Definierte Inversionen unterdrücken meiotische Rekombination zwischen der invertierten und nicht-invertierten Region homologer Chromosomen und können daher als definierte Balanzierchromosomen dienen. Auch definierte Deletionen/Duplikationen wurden in D. melanogaster generiert. Solche Abberationen werden entscheidend dazu beitragen können, damit in anderen Insektenarten, wie T. castaneum, Mutantenstämme sicher gehalten bzw. Genfunktionen identifiziert werden können. Zudem ermöglicht die Trennung der terminalen, invertierten Sequenzwiederholungen von transponierbaren Elementen durch die Invertierung der chromosomalen Region zwischen zwei Transposons deren Immobilisierung. Dies ist von entscheidendem Interesse für die Anwendung von transgenetischen Ansätzen in der Insektenschädlingsbekämpfung, wenn transgene Insekten freigesetzt werden sollen und daher die transponierbaren Elemente effizient vor einer potentiellen Kreuzmobilisierung in der Wirtsspezies geschützt werden müssen.