Abschätzung der mikrobiellen Diversität in anoxisch sauren Sedimenten von Braunkohle-Restseen unter Berücksichtigung des Eisenschwefelkreislaufs

Titelangaben

Blöthe, Marco:
Abschätzung der mikrobiellen Diversität in anoxisch sauren Sedimenten von Braunkohle-Restseen unter Berücksichtigung des Eisenschwefelkreislaufs.
Bayreuth , 2004
( Dissertation, 2005 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Das Sediment im Restsee 77 wird durch den Verlauf des pH-Wertes dominiert. Dieser liegt im oberen Bereich bei 3 und steigt mit der Tiefe auf Werte von 5,5-6 an. Anhand des pH-Verlaufs wurde das Sediment in die Zonen I bis IV unterteilt. In Zonen I und III konnte eine spontane Fe(II)ges.-Freisetzung beobachtet werden, wobei diese in Zone I abhängig vom pH-Wert war. Diese konnte durch eine Anhebung des pH um den Faktor 2,2 gesteigert werden. Für die Zone III konnte bei Absenkung des pH-Wertes hingegen kein eindeutiger Effekt beobachtet werden. Mit Anstieg des pH im Sediment konnte zwar eine Abnahme der Zellzahl/ml beobachtet werden, die Diversität der Mikrobiota stieg jedoch an. Dies konnte mit unterschiedlichen molekularbiologischen Methoden bestätigt werden. Die allgemeine sowie die DGGE-Klonbibliothek wiesen in Zonen III eine höhere Diversität als in Zone I auf. Dominierend war die ubiquitär vorkommende Gruppe der Acidobacteria. Allerdings ist bis heute mit A. capsulatum nur eine Art kultiviert worden, von der eine dissimilatorische Fe(III) Reduktion nicht bekannt ist. Die allgemeinen Klondatenbank enthielt keinen Hinweis auf eine spezifische Fe(III)-reduzierende Mikrobiota. Von den bis heute bekannten dissimilatorischen Fe(III)-Reduzierern wurden nur Vertreter aus der Gruppe der Geobacteriaceae gefunden. Mit dem Primer-Set GM3/Geo825R für Geobacter konnte ein positives Signal in Zone III bei einer Verdünnugsstufe von 10-1 erhalten werden. In Zone I und Zone II lag die höchste positive Verdünnungsstufe bei 100. Mit dem Primer-Set Gb564/Gb1290 ergab sich ein leicht abgewandeltes Bild. Mit diesen Primern lag die höchste positive Verdünnungsstufe in Zone II und Zone III bei 10-2. Hingegen konnte in Zone I nur mit der unverdünnten DNA ein positives Signal erhalten werden. Mit den für Geothrix spezifischen Primern konnte nur in Zone II bis zu einer Verdünnungsstufe von 10-1 ein positives Signal erhalten werden. Allerdings bestand das erhaltene Produkt aus einer Doppelbande, was auf eine unspezifischen Reaktion während der PCR hindeutet. Kein positives Signal konnte für Shewanella erhalten werden. Für die azidophilen Fe(III)-Reduzierer konnte eine Anpassung beobachtet werden. Für die Acidiphilium-Spezies konnten acht Phylotypen differenziert werden, von denen vier in Zone I und III vorkamen. Die restlichen vier wurden hingegen nur in Zone III nachgewiesen. Ein Sequenzvergleich der Phylotypen aus Zone I und Zone III mit der EMBL-Datenbank ergab ausschließliche Ähnlichkeiten von 99% zu Acidiphilium-Spezies. Die Sequenzen der vier Phylotypen aus Zone III waren zu 95% sequenzähnlich zu kultivierten Acidiphilium oder Acidosphaera Spezies. Die phylogenetische Analyse ergab zwei Gruppen. Gruppe 1 enthält die Phylotypen, die nur in Zone III gefunden wurden. Die Phylotypen von Zone I und Zone III clusterten in Gruppe 2. Für die 'Bioleaching-Assoziierten'-16S rDNA wurden 20 Klone aus Zone I und 28 Klone aus Zone III auf redundante Klone über RFLP gescreent, wobei nur 1 Phylotyp mit 99%ige Sequenzähnlichkeit mit A. ferrooxidans unterschieden werden konnte. A. ferrooxidans reduziert unter sauren pH-Bedingungen (pH 3) mit 20 mM S° als Elektronenquelle alle getesteten Eisenfestphasen, wobei die Fe(II)ges.-Freisetzung mit abnehmender Kristallinität der Fe(III)-Minerale zunimmt. Unter erhöhten pH-Bedingungen (pH 5) erfolgte keine nennenswerte Fe(III)-Reduktion. Die Ergebnisse mit den Reinkulturen deuten darauf hin, dass autotrophe azidophile Fe(III)-Reduzierer unter erhöhten pH-Werten keinen Beitrag zur Fe(III)-Reduktion in Zone III leisten. Eine Fe(III)-Reduktion konnte ebenfalls für den heterotrophen Modellorganismus A. capsulatum gezeigt werden. In Reinkulturexperimenten mit A. capsulatum wurde die Fähigkeit zur Fe(III)-Reduktion getestet. Dabei konnte gezeigt werden, das sowohl Fe(III)-Minerale als auch lösliche Fe(III)-Formen in einem pH-Bereich von 2,2-5 reduziert werden. Hierbei werden zwischen 5 und 40% der aus der Glukoseoxidation gewonnenen Elektronen auf Fe(III) übertragen. Die von PEINE (1998) formulierte Hypothese eins gekoppelten Eisen-Schwefelkreislaufs konnte an zwei Anreicherungskulturen sowie einem Isolat demonstriert werden. Hierbei wurden unterschiedliche Prozesse identifiziert. Anreicherungskulturen MB1 und MB2 oxidierten elementaren Schwefel bzw. Thiosulfat, wobei die Elektronen auf die Fe(III)-Minerale übertragen werden. Isolat MB3 betrieb eine Disproportionierung, bei der das gebildete Sulfid mit den Fe(III)-Mineralen chemisch zu Fe(II) und elementarem Schwefel reagiert. Beide Prozesse gehen vom elementarem Schwefel aus, der im Sediment durch eine Reaktion des Sulfids aus der Sulfatreduktion mit den Fe(III)-Mineralen entsteht. Die Bildung von elementarem Schwefel als Reaktionsprodukt aus der chemischen Reaktion von Na2S mit Fe(III) unter sauren Bedingungen konnte sowohl in Batch-Versuchen als auch in Mikrokosmenexperimenten gezeigt werden.

Abstract in weiterer Sprache

The sediment in lake 77 is characterised by the pH. In the upper part the pH is constant around 3 and increase with the depth to pH 5,5-6. The increase of the pH takes place in a narrow range. This characteristic pH trend was used to separate the sediment into four different zones. In zone I and III a spontaneous Fe(II)ges.-release was observed over 60 days. In Zone I Fe(II)ges.-release was pH-dependent. Parallel to the rising pH the total cell numbers decrease while the microbial diversity increased. This was confirmed with different molecular methods like DGGE or clone libraries. A dominating bacterial group in zone I and zone III common clone libraries were members of the Acidobacteria and a iron reducing microbiota was not found. In a ”dilution-PCR” with specific primers for Geobacter a positive signal was obtained in zone III up to a 10-3 dilution. In zone I and II a signal was obtained only with undiluted DNA. No signal were obtained with specific primer-set for Geothrix or Shewanella species. For the acidophilic iron reducers a adaptation to the different zones was observed. 8 different phylo-types for Acidiphilium-species were found by cloning procedure. 4 of this phylo-types were found in zone I and zone III while the remaining were found in zone III only. The 16S-sequence of all this 8 phylo-types were similar to Acidiphilium-species. For the „bioleeaching-associated” microbiota like Acidithiobacillus ferrooxidans only only phylo-type were found in zone I and zone III. From this results we conclude that the high diversity of the heterothrophic acidophilic iron reducers is In pure-culture experiments A. ferrooxidans was capable to reduce iron with elemental sulphur only under pH 3. The capacity of iron reduction increased with higher crystalinity of the tested iron minerals. From this results we conclude that the autotrophe acidophilic iron reducers have no contribute to iron reduction under slithly acidic pH conditions. The postulated hypothesis of a coupled iron-sulfur cycle in the sediment of lake 77 by PEINE (1998) could be confirmed by investigation of two enrichment cultures and one islolat. We were able to differentiate between two processes. The two enrichment cultures MB1 and MB2 oxidised elemental sulphur and thiosulfate respectively. During this oxidation Fe(III) was reduced. In contrast isolate MB3 disproportionated elemeantal sulphur to sulphate and sulphide. The end product sulphide reacted chemically with the iron minerals to Fe(II) and elemental sulphur. Both processes starts from elemental sulphur which can be accounted as a “end product” of the sulphate reduction in the sediment by a chemical reaction of the sulphide with the iron minerals.