Funktionale Analyse des ATPase- und des Zn2+-Bindungs-Motivs der Bacillus subtilis Protease FtsH und deren Einfluss auf die Sporulation

Titelangaben

Kotschwar, Matthias:
Funktionale Analyse des ATPase- und des Zn2+-Bindungs-Motivs der Bacillus subtilis Protease FtsH und deren Einfluss auf die Sporulation.
Bayreuth , 2004
( Dissertation, 2004 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Die membrangebundene, ATP- und Zn2+- abhängige Metalloprotease FtsH ist in E. coli bereits gut untersucht. Es handelt sich um ein multifunktionales Protein mit ATPase- und Protease-Aktivität. Dort wurden eine Vielzahl von E. coli ftsH-Mutanten mit pleiotropen Phänotyp charakterisiert und die Auswirkung von gezielten Mutationen in vivo und in vitro analysiert (Akiyama et al., 1994; Akiyama et al., 1996). Über FtsH aus B. subtilis ist hingegen noch wenig bekannt. Bisher wurden erst die Phänotypen einer ftsH-Nullmutante und einer Insertionsmutante beschrieben, die zu einem pleiotropen Phänotyp führen. Die Rolle bestimmter Bereiche oder Aminosäuren von FtsH wurden hier nicht untersucht (Deuerling et al., 1995; Deuerling et al., 1997; Lysenko et al., 1997). In ihrer Diplomarbeit konstruierte Eva Harfst 1999 vier B. subtilis ftsH-Allele, indem sie gezielt Aminosäuren in der Walker-A-Box und im Zinkbindungsmotiv austauschte, wie sie bereits für E. coli und Hefe FtsH beschrieben wurden. Diese mutierten ftsH-Gene und ein wildtypisches zur Kontrolle brachte sie in den pX-Vector ein, wodurch sie unter die Kotrolle eines Xylose-induzierbaren Promotors gestellt wurden. In der vorliegenden Arbeit wurden die mutierten ftsH-Allele in das B. subtilis-Chromosom integriert und in einem zweiten Schritt das wildtypische ftsH deletiert. Die Phänotypen der so erzeugten Mutanten (sowohl die aus dem ersten Schritt, die noch das wildtypische ftsH tragen, als auch die aus dem zweiten Schritt, die nur noch das mutierte Allel tragen) wurden hinsichtlich des filamentösen Wachstums, der Sporulation, der Sensitivität gegenüber Hitzeschock und hyperosmotischen Bedingungen analysiert. Dabei stellte sich heraus, das die mutierten Allele keinen Einfluss auf den Phänotyp der Stämme haben, die das wildtypische ftsH noch tragen, und in den Knockout-Stämmen das wildtypische ftsH nicht ersetzen können, also den Phänotyp einer ftsH- Nullmutante zeigen. Des weiteren sind die mutierten ftsH-Allele ebenfalls nicht in der Lage, die Defizienz in der Subtilisin-Sekretion zu kompensieren. ATPase-Tests zeigten, dass die eine Mutation im Walker-A-Motiv die ATPase-Aktivität der beiden betroffenen Proteine ausschaltete. Protease-Tests ergaben, dass keines der mutierten FtsH-Proteine noch eine Protease-Aktivität aufweist. Das bedeutet, dass einerseits die Basenaustausche im Zinkbindungsmotiv die Protease-Aktivität ausschalten, andererseits aber auch keine Protease-Aktivität ohne ATPase- Aktivität möglich ist. Daraus folgt weiterhin, dass die ATPase-Aktivität des FtsH-Proteins allein nicht ausreicht, um einen der untersuchten pleiotropen Phänotypen einer ftsH--Mutante zu kompensieren. Die Funktionalität sowohl der ATPase- als auch der Protease-Domäne ist also für FtsH und somit für B. subtilis hinsichtlich des filamentösen Wachstums, der Sporulation, der Sensitivität gegenüber Hitzeschock und hyperosmotischen Bedingungen essentiell. Anhand von Northern-Blot-Hybridisierungsexperimenten konnte gezeigt werden, dass FtsH eine essentielle Rolle bei der Phosphorylierung von Spo0A haben muss, da ohne FtsH kein aktives Spo0A gebildet wird. Die daraus resultierende Sporulationsdefizienz kann aber durch eine Spo0A-Mutante, die ohne Phosphorylierung aktiv ist, fast vollständig kompensiert werden. FtsH ist also während der Sporulation nur für die Phosphorylierung von Spo0A essentiell.

Abstract in weiterer Sprache

In E. coli the membrane bound, ATP- and Zn2+-dependent metalloprotease FtsH is already well known. It is a multifunctional Protein with ATP- and protease-activity. A multitude of ftsH-mutants with a pleiotropic phenotype have been characterized in E. coli and the results of precise point-mutations have been analysed in vitro and in vivo (Akiyama et al., 1996). There is little known about FtsH in B. subtilis. Just the phenotypes of a ftsH-knockout and an insertion-mutant have been described until now, that lead to a pleiotropic phenotype. The role of special regions or amino acids of FtsH have not been examined jet (Deuerling et al., 1995; Deuerling et al., 1997; Lysenko et al., 1997). In 1999 Eva Harfst constructed four B. subtilis ftsH-alleles during her diploma work, by specific exchanges of amino acids in the Walker-A-box and the Zinc-binding-motive , which have been already described for FtsH of yeast and E. coli. She cloned these mutated ftsH-genes and one wild type allele into the pX-vector and brought them under the control of a xylose inducible promoter. In this work the mutated ftsH-alleles were integrated into the chromosome of B. subtilis and in a second step the wildtyp ftsH was deleted. The phenotypes of these mutants (those which were carrying also the wildtyp and the mutated ftsH-gene and those which had just the mutated gene) have been analysed for filamentous growth, sporulation and sensitivity against heat-shock hyperosmotic stress. The mutated alleles had no influence on those strains which were also carrying the wildtyp ftsH and complement those without, showing the phenotype of an ftsH-knockout. Further the mutated ftsH-alleles can not compensate the Subtilisin-secretion deficiency. ATPase-tests are showing, that a the mutation within the Walker-A-motive disables the ATPase-activity of both proteins, carrying these mutation. Protease-tests were showing, that none of the mutated FtsH-proteins had any protease-activity anymore. So the base-exchange within the Zinc-binding-motive disables the protease-activity as the lack of ATPase-activity does. Therefore the ATPase-activity is not enough to compensate the phenotype of a ftsH-knockout. The functionality of both, the ATPase- and the protease-domain are essential for growth behaviour, sporulation and sensitivity against heat-shock and hyperosmotic-stress. Northern-blot-experiments revealed, that FtsH should have an essential role in the phosphorylation of Spo0A, because no active Spo0A is build in absence of FtsH. The resulting sporulation-deficiency can be compensated nearly totally by an Spo0A-mutant, which is in an active state even without phosphorylation. So it seems FtsH is mainly just responsible for the phosphorylation of Spo0A.