Änderungen intramolekularer Abstände bei der Faltung des Kälteschockproteins aus Bacillus caldolyticus

Titelangaben

Magg, Christine:
Änderungen intramolekularer Abstände bei der Faltung des Kälteschockproteins aus Bacillus caldolyticus.
Bayreuth , 2004
( Dissertation, 2005 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Das kleine Kälteschockprotein Bc-Csp bildet ein beta-barrel aus fünf antiparallelen beta-Faltblattsträngen. Es faltet gemäß einem Zweizustandsmechanismus und erreicht den nativen Zustand in Abwesenheit von Denaturierungsmittel innerhalb einer Millisekunde. Um die strukturellen Veränderungen während dieser schnellen Faltungsreaktion zu untersuchen, wurden intramolekulare Abstandsänderungen mit Hilfe des Förster-Resonanzenergietransfers (FRET) bestimmt. Einzelne Tryptophanreste wurden als Donor und einzelne 5-(((acetylamino)ethyl)amino)-naphthalin-1-sulfonsäure-Reste (AEDANS) als Akzeptor in das Protein eingeführt. An der Oberfläche von Bc-Csp wurden vier verschiedene Donor- und vier verschiedene Akzeptorpositionen ausgewählt. Diese Positionen wurden zu neun einzelnen Donor-Akzeptor Proteinvarianten kombiniert, so daß Änderungen von neun intramolekularen Abständen verfolgt werden konnten. In den nativen Proteinen betrugen diese Abstände zwischen 1,4 und 2,8 nm. Für das Trp/AEDANS Paar liegt der charakteristische Transferabstand im Bereich von 2,2 nm, was ungefähr dem Durchmesser von Bc-Csp entspricht und daher sehr empfindliche Messungen ermöglicht. In den einzelnen Proteinen wurde der Abstand zwischen Donor und Akzeptor sowohl unter nativen als auch unter Entfaltungsbedingungen bestimmt. Für die gefalteten Proteine sind die gemessenen Abstände mit denen aus der Kristallstruktur von Bc-Csp vereinbar, wenn die Länge des AEDANS linker berücksichtigt wird. Bei den entfalteten Proteinen wird eine gute Übereinstimmung mit den berechneten Abständen in einer zufällig angeordneten Peptidkette gefunden. Es gibt daher keinen Hinweis auf nativähnliche Reststrukturen im entfalteten Protein. Die Mutationen und Modifikationen, um sowohl den FRET Donor als auch Akzeptor einzuführen, verringerten die Stabilität von Bc-Csp nur geringfügig und führten zu keiner Veränderung der Rückfaltungsreaktion. Die Änderungen der Transfereffizienz während der Faltung wurden in kinetischen stopped-flow-Experimenten anhand der Trp- und der AEDANS-Fluoreszenz bestimmt. Für diese beiden Sonden wurden reziproke Effekte beobachtet. Bei niedrigen Konzentrationen des Denaturierungsmittels wird bereits in der Totzeit der stopped-flow-Rückfaltungsexperimente ein Anstieg der Transfereffizienz beobachtet, der von einem schnellen Kollaps des entfalteten Proteins verursacht wird. In Abhängigkeit von der Position des Donors und des Akzeptors findet bis zu 70 % der gesamten Abstandsänderung vor dem geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Faltung statt. Mit Drucksprung- und Temperatursprungexperimenten wird eine höhere Zeitauflösung erreicht, aber der Zeitverlauf des Kollapses konnte auch mit diesen Methoden nicht verfolgt werden. In der Totzeit der Temperatursprungmessungen kommt es zu einer schwachen Effizienzänderung, so daß der Kollaps möglicherweise schneller ist als 0,1 Mikrosekunden. Alle Donor-Akzeptor Proteine zeigen unabhängig vom äußerst schnellen Kollaps ein Zweizustandsverhalten im geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Faltung. Es tritt keine Abweichung von der Linearität in den Chevronauftragungen auf, und die kinetischen und die Gleichgewichts-m-Werte stimmen überein. Diese Befunde deuten auf einen kollabierten Zustand hin, der zwar eine kompakte Struktur besitzt, aber für Wasser und Denaturierungsmittel immer noch gut zugänglich ist. Beide Eigenschaften konnten mit Hilfe verschiedener Lösungsmittelzusätze bestätigt werden: Ammoniumsulfat stabilisiert den kompakten kollabierten Zustand, durch Ethylenglykol wird er hingegen destabilisiert. Ethylenglykol wird vom immer noch lösungsmittelzugänglichen Peptidrückgrat des kollabierten Zustands ausgeschlossen. Beim kollabierten Zustand handelt es sich also nicht um ein gut definiertes, teilgefaltetes Intermediat. Der entfaltete und der kollabierte Zustand von Bc-Csp sind wahrscheinlich nicht durch eine Energiebarriere getrennt, sondern bilden zusammen ein Kontinuum von Konformationen mit unterschiedlicher Kompaktheit. Thermodynamisch betrachtet können die kollabierten Moleküle so dem entfalteten Zustand zugeordnet werden. Der Kollaps der Peptidkette ist eine Reaktion auf den Transfer in ein schlechteres Lösungsmittel bei der Rückfaltung. Dieser kollabierte Zustand verzögert den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Faltung nicht, und daher erfolgt die effiziente und schnelle Bildung des nativen Zustands von Bc-Csp innerhalb von Millisekunden.

Abstract in weiterer Sprache

The small cold shock protein Bc-Csp forms a five-stranded antiparallel beta-barrel. Its folding follows a two-state mechanism and is complete within a millisecond in the absence of denaturant. The structural changes during this rapid folding reaction were investigated by measuring distance changes within the protein by Förster resonance energy transfer (FRET). Single tryptophan residues were engineered into the protein as the donors and combined with single 5-(((acetylamino)ethyl)amino)naphthalene-1-sulfonate (AEDANS) residues as the acceptors. Four different donor and four different acceptor sites at the protein surface of Bc-Csp were selected. They were variably combined to give nine single donor-acceptor labelled protein variants, which accordingly could be used to probe the changes in nine intramolecular distances during folding. In the native proteins these distances were between 1.4 and 2.8 nm. The Förster distance of the Trp/AEDANS pair is around 2.2 nm, which equals the diameter of Bc-Csp and allows highly sensitive measurements. For the individual proteins the distance between donor and acceptor was determined under native and under unfolding conditions. In the native proteins the measured distances are compatible with those derived from the crystal structure of Bc-Csp, when the length of the AEDANS linker is accounted for. For the unfolded proteins a good correlation is found with the calculated distances in a randomly oriented chain. Thus there is no evidence for residual native structure in the unfolded protein. The mutations and modifications to introduce both the FRET donor and acceptor reduced the stability of the proteins only marginally and did not alter their refolding kinetics. The changes in the transfer efficiency during folding were monitored in kinetic stopped-flow experiments by both Trp- and AEDANS-fluorescence and reciprocal effects were found. At low denaturant concentrations an increase of the transfer efficiency is observed already in the dead-time of stopped-flow refolding experiments, which is due to a rapid collapse of the unfolded protein. Depending on the position of the donor and acceptor up to 70 % of the total change in distance is complete before the rate-limiting step of folding. A higher time-resolution was reached in pressure-jump and temperature-jump experiments, but the kinetics of the collapse could not be resolved even with these methods. There is a small change in the dead-time of the temperature-jump, so possibly the collapse is faster than 0.1 microseconds. Irrespective of the very rapid collapse, all donor-acceptor proteins show two-state-behaviour in the rate-limiting step of folding. There is no deviation from linearity in chevron plots or a difference between kinetic and equilibrium m-values. These findings point to a collapsed state, which is compact in shape but still highly accessible to solvent and denaturants. Both features could be confirmed by the use of different cosolvents: Ammonium sulfate stabilises the compact collapsed state, whereas ethylene glycol destabilises it, because it is excluded from the still solvent-accessible peptide backbone of the collapsed state. Therefore the collapsed state is not a well defined, partially folded intermediate. The unfolded and collapsed states of Bc-Csp are probably not separated by an energetic barrier but form a continuum of conformations with a varying degree of compactness. Thermodynamically, the collapsed molecules thus belong to the unfolded state. The collapse represents a contraction of the peptide chain upon transfer to a poor solvent in refolding experiments. This collapsed state does not retard the rate-limiting step of folding, and thus the efficient and fast formation of the native state of Bc-Csp occurs within milliseconds.