Measuring juvenile hormone and ecdysteroid titers in insect haemolymph simultaneously by LC-MS: The basis for determining the effectiveness of plant-derived alkaloids as insect growth regulators

Titelangaben

Westerlund, Stephanie A.:
Measuring juvenile hormone and ecdysteroid titers in insect haemolymph simultaneously by LC-MS: The basis for determining the effectiveness of plant-derived alkaloids as insect growth regulators.
Bayreuth , 2004
( Dissertation, 2004 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Aim of this thesis was to develop a liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) method to monitor hormones and their metabolites in the haemolymph of insects simultaneously. Furthermore, some plant-derived alkaloids were structurally elucidated, which may be used as insect growth regulators thus affecting haemolymph hormone titers in putative pest species. Juvenile hormones (JHs), JH diols and ecdysteroids were easily separated by high performance-liquid chromatography (HPLC) in less than 20 min using a reversed-phase C18 column and a methanol-water gradient. Subjecting the JH-JHBP (juvenile hormone binding protein) complex to HPLC was sufficient in releasing JH from the JHBP. In order to prevent JH from binding to glass surfaces, it was necessary to include a carrier in the solvent. JHs have a high affinity to polypropylene vials and should therefore be avoided, if no carrier is being used, such as triton X-100. The darkening of the haemolymph due to eumelanin production by phenol oxidases served as a visual indicator of general enzyme activity in the haemolymph. Isooctane:MeOH (1:1, v/v) inactivated the phenol oxidase system when used at a solvent-haemolymph ratio of 10. An isooctane:MeOH extract of haemolymph was most efficient in keeping JH distributed evenly in solution and prevented JH from adhering to the glass vessel. JH concentration in standard solutions was reduced with increasing sonication time. Highest ionization of JH was achieved in MeOH for MS compared to ACN or by using formic acid as an additive. In the positive ESI (electrospray ionization) mode the most abundant ions formed in haemolymph extract of Gryllus bimaculatus was the sodium adduct for JHs, JH diols and JH acids. At higher JH concentrations, the potassium adduct was also observed. The sodium and the potassium adducts were present in ecdysteroid analysis. The same ionization pattern was observed in Spodoptera frugiperda, Myrmicaria eumenoides and Acyrthosiphon pisum haemolymph. Method validation of the LC-MS method confirmed reproducibility and repeatability. The LODs for JHs and JH diols were between 6 to 12 pg, and 93 pg for ecdysteroids. 72 haemolymph samples can be processed per day by the LC-ESI-MS method using an autosampler. JH and ecdysteroid titer measurements showed good agreement between haemolymph titers and developmental events in Spodoptera frugiperda and Gryllus bimaculatus larvae and Gryllus bimaculatus adults. In Gryllus bimaculatus female and male last instar larvae, the JH titers were low and steady until day 6. The ecdysone peak maximum shifted from day 3 to a 20-hydroxyecdysone maximum peak on day 5, coinciding with the onset of adult ecdysis. JH III titers increased on day 3 in paired Gryllus bimaculatus males, occurring simultaneously with spermatophore maturation and deposition. A similar response was seen with ecdysone titers. Mated female crickets experienced a JH III titer increase on day 4 which coincides with egg deposit on day 4. Ecdysone titers reach a maximum on day 3 and ovary weights on day 4. Besides JH III, JH I was found in 5 to 8-day old female adult crickets, and in 6 and 7-day old male adult crickets. 20-Hydroxyecdysone was found neither in female nor in male Gryllus bimaculatus mated adults. The “classical” interplay between JHs and ecdysteroids was observed in 5th instar Spodoptera frugiperda larvae. JH titers decreased towards the end of the larval stadium and 20-hydroxyecdysone gave a sharp peak on the last day of the 5th instar. Extremely low levels of JH were measured in 6th instar larvae. 20-Hydroxyecdysone and ecdysone titers increased simultaneously in prepupae. The already known alkaloids arborinine and arborine, and the for the first time isolated 4-methoxy-1-methyl-2(1H)-quinolinone from Glycosmis pentaphylla, were extracted from Glycosmis pentaphylla leaves and are discussed as possible insect growth regulators affecting hormone titers in the haemolymph of insect pest species.

Abstract in weiterer Sprache

Ziel der Untersuchungen war die Entwicklung einer LC-MS (liquid chromatography-mass spectrometry) Methode zur Bestimmung von Hormonen und ihren Metaboliten in der Hämolymphe von Insekten. Darüber hinaus wurden einige Alkaloide aus Pflanzenblättern in ihrer Struktur aufgeklärt, die als Insektenwachstumsregulatoren bei der Bekämpfung von Schädlingen eingesetzt werden könnten. Juvenilhormone (JH) und deren Diole (JH-Diole) konnten zusammen mit Ecdysteroiden auf einer HPLC (high performance-liquid chromatography) C18-Säule mühelos in weniger also 20 min aufgetrennt werden, wenn ein Methanol-Wasser-Gradient verwendet wurde. Juvenilhormone werden bereits per HPLC Auftrennung von ihrem JH Bindungsprotein gelöst. Ein Trägerstoff ist notwendig, um einen Juvenilhormonverlust durch JH-Bindung an Glas zu vermeiden. Als gute JH-Trägerstoffe haben sich Isooctan:MeOH-Hämolymphextrakte bewährt. Juvenilhormone werden homogener in der Lösung verteilt als in MeOH und bleiben nicht am Glas haften. Beim Umgang mit geringen Juvenilhormonkonzentrationen eignen sich Kunststoffgefäße aufgrund ihrer hohen JH-Affinität nicht. Isooctan:MeOH (1:1, v/v) verhinderte die Aktivierung von Phenoloxidasen und eine Verfärbung der Hämolymphe, wenn das 10-fache Lösungsmittelvolumen gegenüber dem Hämolymphvolumen genommen wird. Auf diese Weise werden wohl alle Enzyme in der Hämolymphe inaktiviert. Ultraschall-Behandlung vermindert die Juvenilhormonkonzentration in Lösungen. Die höchste Ionisierungsausbeute des Juvenilhormons wurde in MeOH erzielt. ACN oder Zusätze (z.B. Ameisensäure) konnten die Empfindlichkeit nicht erhöhen. In der Hämolymphe werden im positiven Ionisierungsmodus die Juvenilhormone und deren Diole hauptsächlich zu Natrium-Addukten umgewandelt. Bei hohen JH –Konzentrationen und bei der Ecdysteroidanalyse fanden sich noch zusätzlich Kalium-Addukte. Gleiche Ionisierungsmuster wurden auch in der Hämolymphe von Spodoptera frugiperda, Myrmicaria eumenoides und Acyrthosiphon pisum festgestellt. Reproduzierbarkeit und Wiederholbarkeit sind bei der LC-ESI-MS Methode gewährleistet. Die Nachweisgrenzen lagen zwischen 6 und 12 pg für die Juvenilhormone und Diole, und bei 93 pg für die Ecdysteroide. Pro Tag können 72 Hämolymphproben mit Hilfe der LC-MS Methode und eines Autoinjektors analysiert werden. Die gemessenen Juvenil- und Ecdysteroidtiter stimmen gut mit den jeweiligen Entwicklungsstadien von Spodoptera frugiperda und Gryllus bimaculatus Larven und Gryllus bimaculatus Adulten überein. Die JH-Titer in weiblichen und männlichen Gryllus bimaculatus Larven im letzten Larvalstadium waren gering, aber konstant bis zum 6. Tag. Ein Anstieg des Ecdysontiters am 3. Tag wurde von einem Anstieg des 20-Hydroxyecdysontiters am 5. Tag begleitet. Ein Anstieg des JH III-Titers in verpaarten adulten männlichen Grillen am 3. Tag ist wahrscheinlich mit der sexuellen Reifung verbunden. Zeitgleich steigt auch der Ecdyson-Titer an. In den verpaarten Grillenweibchen steigt der JH III-Titer am 3. Tag an und erreicht ein Maximum am 4. Tag. Der Ecdyson-Titer steigt ebenfalls am 3. Tag an. Zu diesem Zeitpunkt sind die Ovarien am schwersten und das Weibchen beginnt mit der Eiablage. Neben JH III wurde in 5- bis 8-tägigen weiblichen und in 6- bis 7-tägigen männlichen adulten Grillen JH I nachgewiesen. 20-Hydroxyecdyson wurde weder in den adulten Weibchen noch in den adulten Männchen von Gryllus bimaculatus nachgewiesen. Das „klassisches“ Beispiel der Hormonkoordination vor und während der Häutung konnte beim 5. Larvalstadium von Spodoptera frugiperda beobachtet werden. Der JH-Titer sinkt zum Ende des Larvalstadiums, während der 20-Hydroxyecdyson-Titer ansteigt. Während des 6. Larvalstadiums sind die JH-Konzentrationen in der Hämolymphe sehr gering. Während des Vorpuppenstadiums ist ein leichter Anstieg des JH-Titers zu beobachten. Ecdyson- und 20-Hydroxyecdyson-Titer steigen rapide im Vorpuppenstadium an. Die bereits bekannten Alkaloide Arborinin und Arborin, und das erstmals aus Glycosmis pentaphylla extrahierte 4-Methoxy-1-methyl-2(1H)-chinolinon, wurden aus Glycosmis pentaphylla Blättern isoliert. Ihre Rolle als potentielle Insektenwachstumsregulatoren wird diskutiert.