Molekularsystematische Untersuchungen an Vertretern der pflanzenparasitischen Gattung Exobasidium (Basidiomycota)

Titelangaben

Döring, Heidi:
Molekularsystematische Untersuchungen an Vertretern der pflanzenparasitischen Gattung Exobasidium (Basidiomycota).
Bayreuth , 2003
( Dissertation, 2004 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Artabgrenzungen und Phylogenie in der pflanzenparasitischen Pilzgattung Exobasidium wurden mit molekularen Markern untersucht. Das allgemein akzeptierte Artkonzept für die europäischen Arten dieser Pflanzenparasiten basiert auf Wirtsspezifität und den hervorgerufenen Befallsbildern. Erste molekulare Studien (GC-Gehalt, DNA-DNA-Homologie) bestätigten dies jedoch nicht in allen Fällen. Daher wurden in dieser Arbeit Artabgrenzungen im Kontext phylogenetischer Zusammenhänge mit Hilfe von RFLPs und Sequenzdaten untersucht. Der Schwerpunkt liegt auf Pilzstämmen von europäischen Wirtsarten der Gattungen Vaccinium und Rhododendron, wozu hefeartig wachsende Kulturen der saprotrophen Lebensphase dieser Pilze bearbeitet wurden. Zur molekularen Charakterisierung wurden mit 6 Restriktionsenzymen RFLPs eines PCR-Amplifikates ermittelt. Der amplifizierte Genabschnitt kodiert ca. 2.2 kb des 5’-Bereichs der 26S rRNA. Darüber hinaus wurden Sequenzvergleiche der Domäne I der 26S rDNA, der 18S rDNA und der ITS-Region durchgeführt. Übereinstimmung in den PCR-RFLP-Mustern des 5’-Bereichs der 26S rDNA zeigt Konspezifität an, da solche Stämme einen ähnlichen GC-Gehalt und hohe DNA-DNA-Homologien aufweisen. Insgesamt wurden über alle 6 Enzyme bei 51 untersuchten Stämmen 20 RFLP-Gruppen gefunden. Jedoch finden sich Stämme von einer Wirtspflanze oder solche mit hoher DNA-DNA-Homologie auch in verschiedenen RFLP-Gruppen. Zusätzlich zeigen sich in Dendrogrammen auffallende Unterschiede in den Distanzen zwischen einzelnen RFLP-Mustern. Eine nachfolgende Analyse der Sequenzen der Domäne I der 26S rDNA bestätigte, daß Stämme einer RFLP-Gruppe Angehörige einer Art sind, daß aber Stämme einer Art durchaus unterschiedlichen RFLP-Gruppen angehören können. Unter Berücksichtigung der DNA-DNA-Homologie-Daten kann beim Auftreten von weniger als 3 bp Unterschied in der Domäne I der 26S rDNA Konspezifität festgestellt werden. Unterschiede in den RFLP-Mustern können somit Konspezifität nicht widerlegen. Für z.T. unerwartete Ergebnisse der RFLP-Analysen ließen sich in Sequenzanalysen 2 Gründe feststellen. Die amplifizierte Region der 26S rDNA kann Group-I-Introns enthalten (an Position 929/930 bzw. 1.127/1.128 der 26S rDNA bezogen auf Saccharomyces cerevisiae). Die Verteilung der Group-I-Introns zwischen Stämmen, welche aufgrund der übereinstimmenden Sequenzen der Domäne I der 26S rDNA und ihrer DNA-DNA-Homologie als konspezifisch anzusehen sind, zeigt, daß sie bei Exobasidium spp. nicht artspezifisch auftreten. Außerdem gruppieren einige Stämme (3 Arten) in phylogenetischen Analysen in anderen Verwandtschaftskreisen der Ustilaginomyceten, wodurch sie als kontaminierende Pilze identifiziert werden. Diese Stämme waren früher mit biochemisch-physiologischen Merkmalen nicht gegen Exobasidium spp. abzugrenzen. Stämme einer Art stammen dabei von verschiedenen Wirtspflanzen und widersprachen so früher einem auf hoher Wirtsspezifität basierenden Artkonzept. Datenbankvergleiche der Domäne I der 26S rDNA und deren phylogenetische Analyse im Kontext der Ustilaginomyceten ergaben Affinitäten zu den Entylomatales (Tilletiopsis washingtonensis, Entyloma spp.) bzw. Ustilaginales (Ustilago maydis). Analysen der 18S rDNA und ITS-Region ausgewählter Stämme bestätigten dies. Für phylogenetische Analysen der Gattung Exobasidium wurden Sequenzen der Domäne I der 26S rDNA ausgewählter Stämme untereinander und mit GENBANK-Einträgen verglichen. Hierbei korrespondieren Exobasidium-Arten gut mit den Wirtspflanzen. Sie zeigen eine hohe Wirtsspezifität. Konspezifische Stämme lösen auch dasselbe Befallsbild aus, wobei E. vaccinii eine Ausnahme zu bilden scheint, da Stämme, die auf Vaccinium vitis-idaea eine lokale Gallbildung hervorrufen, sich nicht von Stämmen unterscheiden, welche eine systemische Infektion verursachen. Auch zeigt sich, daß von europäischen Rhododendren isolierte Stämme, die traditionell E. rhododendri zugeordnet werden, distinkte, nicht konspezifische Gruppen bilden. In phylogenetischen Analysen im Kontext der Ustilaginomyceten bilden die Exobasidiales eine gut gestützte Gruppe. Innerhalb der Ordnung werden mit verschiedenen Verfahren zur Stammbaumrekonstruktion unterschiedliche phylogenetische Hypothesen wiedergegeben. Die Exobasidiaceae bilden nur in Distanzanalysen eine monophyletische Gruppe. Zudem gruppieren die Gattungen Arcticomyces und Muribasidiospora immer innerhalb der Exobasidium-Arten und die Eigenständigkeit dieser Gattungen erscheint fraglich. Insgesamt legen die phylogenetischen Analysen eine Kospeziation oder Koevolution zwischen exobasidialen Pilzen und ihren Wirten nahe. Jedoch zeigen sich komplexe Speziationsprozesse in der Evolution dieser pflanzenparasitischen Pilze. Bei Exobasidien von Wirten der Vaccinioideae ergeben sich Muster, die nur mit Wirtswechseln erklärbar sind, und innerhalb des Exobasidium rhododendri-Komplexes muß von der Speziation auf einer Wirtsart ohne Veränderung des Befallsbildes ausgegangen werden.

Abstract in weiterer Sprache

Species delimitation and phylogeny in the plant parasitic fungal genus Exobasidium have been studied using molecular data. The species concept for European taxa is traditionally based on host specificity and disease symptoms caused by the parasites. The first molecular studies on DNA base composition and DNA homologies, however, disagreed with this concept. In this investigation, tools of molecular systematics have been used to test species delimitations and relationships in a phylogenetic context, utilizing RFLP and DNA sequence data. This focusses on fungal strains from European hosts of the genera Vaccinium and Rhododendron, using cultures of the saprotrophic, yeast-like stage of these parasites. RFLPs of a DNA fragment amplified by PCR were generated for a molecular characterization by 6 restriction enzymes. The amplified gene fragment codes for ca. 2.2 kb of the 5’part of the 26S rRNA. In addition, sequence comparisons of the domain I of the 26S rDNA, the 18S rDNA and the ITS region were performed. Strains with identical PCR-RFLP patterns possess a similar G+C content and high DNA homologies. Thus, identity of the RFLP patterns of the 5’part of the 26S rRNA gene indicates conspecificity. The 51 investigated strains formed over all 6 enzymes a total of 20 RFLP groups. Unexpectedly, some strains originating form the same host individual as well as some strains with high DNA homology are found in different RFLP groups. In addition, dendrograms show unequal genetic distances between certain RFLP groups. Subsequent sequence analyses of the domain I of the 26S rDNA confirmed that strains belonging to the same RFLP group are members of a single species, but one fungal species can compromise strains from more than one RFLP group. Conspecificity between strains was established utilizing the available data on DNA homology and a high degree of sequence homology, which is less than 3 bp difference in the domain I of the 26S rDNA. Therefore, differences in RFLP patterns can not contradict conspecificity. Two different reasons for the unexpected results of the RFLP analysis were revealed by sequence analyses. The amplified region of the 26S rDNA contains group I introns (at position 929/930 and 1.127/1.128 compared to the 26S rDNA of Saccharomyces cerevisiae). The distribution of these group I introns among strains, which are conspecific according both to their DNA homology and the similarity of the domain I of the 26S rDNA, shows that the occurrence of an intron is not specific for a given Exobasidium species. Furthermore, in phylogenetic analyses some of the strains (3 species) cluster elsewhere in the Ustilaginomycetes, and could thus be identified as contaminating fungi. These strains could not be separated from Exobasidium spp. by biochemical or physiological characters in previous studies. Earlier, the grouping of these strains, as strains originating from different host plants belong to a single fungal species, had led to a questioning of a species concept based on a high degree of host specificity. Databank comparison of their 26S rDNA partial sequences and phylogenetic analyses in the context of Ustilaginomycetes revealed affinities to the Entylomatales (Tilletiopsis washingtonensis, Entyloma spp.) and Ustilaginales (Ustilago maydis), respectively. This was confirmed by analyses of 18S and ITS rDNA sequence data of selected strains. For phylogenetic analyses of the genus Exobasidium sequences the domain I of the 26S rDNA of selected strains were compared with each other, as well as with sequences retrieved from GENBANK. In these phylogenies Exobasidium species correspond well with host plants. They show a high degree of host specificity. Usually, conspecific strains also cause a specific type of infection. E. vaccinii, however, seems to be an exception, as strains from Vaccinium vitis-idaea either causing systemic infections or leaf galls can not be distinguished. In addition, strains from European Rhododendron species traditionally assigned to E. rhododendri form distinct, non-conspecific groups. Phylogenetic analyses in a broader context of ustilaginomycetous fungi show the Exobasidiales to form a well supported group. Within the order different phylogenetic hypotheses are obtained by different methods of phylogenetic reconstruction. The Exobasidiaceae form a monophyletic group only in neighbor joining analyses. Furthermore, the genera Arcticomyces and Muribasidiospora are always nested within Exobasidium, questioning generic delimitations. In general, the phylogenetic analyses suggest cospeciation or coevolution between exobasidialean fungi and their hosts. However, the results suggest complex speciation processes in the evolution of these plant pathogenic fungi. Within the species occurring on Vaccinioideae host jumps must be considered in order to explain the evolutionary pattern. In addition, in the Exobasidium rhododendri complex within-host speciation has to be considered.