Die Funktion von Three rows bei der Schwesterchromatiden-Trennung in Drosophila melanogaster

Titelangaben

Herzig, Alf:
Die Funktion von Three rows bei der Schwesterchromatiden-Trennung in Drosophila melanogaster.
Bayreuth , 2003
( Dissertation, 2003 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

In der Mitose werden die Schwesterchromatiden getrennt und auf beide Tochterzellen verteilt. Die Trennung der Schwesterchromatiden erfordert die proteolytische Spaltung des Scc1-Proteins. Scc1 ist Bestandteil des Kohäsin-Komplexes, der die Schwesterchromatiden nach ihrer Entstehung in der S-Phase bis zum Beginn der Anaphase gepaart hält. Die Protease, die durch Scc1-Spaltung die Schwesterchromatiden-Trennung einleitet, heißt Separase. Die Separase wird erst dann aktiviert, wenn alle Chromosomen bipolar mit dem mitotischen Spindelapparat verbunden sind. Die Aktivierung der Separase erfordert die Ubiquitinabhängige Degradation des Securins, einer inhibitorischen Untereinheit der Separase. Weitere Mechanismen der Separase-Regulation sind noch nicht vollständig verstanden. Das Securin von Drosophila melanogaster ist das Protein Pimples (PIM). Die Separase (SSE) von D. melanogaster besitzt zwar eine Protease-Domäne, aber die N-terminale regulatorische Domäne, die in Separasen anderer Eukaryoten gefunden wird, fehlt in SSE fast vollständig. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass PIM und SSE einen heterotrimeren Komplex mit dem Protein Three rows (THR) bilden. THR besitzt Bindungsstellen für PIM und SSE. In anderen Organismen besitzt die N-terminale Separase-Domäne Bindungsstellen für das Securin und die Protease-Domäne der Separase. Diese Ergebnisse legen nahe, dass THR strukturell der N-terminalen Domäne anderer Separasen entspricht. Die Separase aus D. melanogaster scheint demnach aus zwei Untereinheiten aufgebaut zu sein. Während SSE die katalytische Domäne der Separase beinhaltet, wurde hier gezeigt, dass THR eine regulatorische Separase-Untereinheit ist. THR wird nach dem Metaphasen-Anaphasen-Übergang proteolytisch gespalten. Diese Spaltung erfolgt nur in funktionellen Separase-Komplexen, und die Spaltstelle in THR entspricht dem Konsensus einer Separase-Spaltstelle. Mutationen in dieser Spaltstelle unterbinden die THR-Spaltung. Diese Daten legen nahe, dass THR durch die katalytische Untereinheit der Separase gespalten wird. Die Expression von nicht spaltbaren THR-Varianten führt zu frühembryonaler Letalität bei erniedrigter Temperatur. Diese Letalität wird unterdrückt, wenn die katalytische Aktivität der Separase erniedrigt wird. Die Spaltung von THR trägt demnach zur Inaktivierung der Separase bei. Die Spaltung von THR ist vor allem während der Zellularisierung wichtig, einem insektenspezifischen Prozess in der Embryonalentwicklung von D. melanogaster. Während der Zellularisierung führt die ausbleibende Inaktivierung der Separase zu Defekten im Tubulin-Zytoskelett. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Separase in D. melanogaster weitere Substrate neben den Kohäsinen und andere Funktionen als in der Schwesterchromatiden-Trennung hat.

Abstract in weiterer Sprache

In mitosis, sister chromatids are separated and distributed onto two daughter cells. Separation of sister chromatids depends on proteolytic cleavage of Scc1. Scc1 is part of the cohesin complex, that holds sister chromatids together after they are synthesized in S-phase until they are separated in anaphase. The protease that initiates sister chromatid separation by cleavage of Scc1 is called separase. Separase is only activated when all chromosomes are attached to the mitotic spindle in a bipolar fashion. Activation of separase involves ubiquitin-dependent degradation of securin, an inhibitory separase subunit. Additional mechanisms that regulate separase activity are still poorly understood. In Drosophila melanogaster, Pimples (PIM) is the securin. The separase (SSE) from D. melanogaster has a protease domain although it lacks most of the N-terminal regulatory domain found in all other eukaryotic separases. It is shown here, that PIM and SSE form a heterotrimeric complex with Three rows (THR). THR has binding sites for both PIM and SSE. The N-terminal domains of other separases have binding sites for the securin and the protease domain of separase. These data suggest that THR structurally corresponds to the N-terminal domain of other separases. Therefore, the separase from D. melanogaster appears to consist of two independent subunits. While SSE includes the catalytic separase domain, THR was found to be a regulatory separase subunit. THR is cleaved after the metaphase-to-anaphase transition. Cleavage only occurs in functional SSE complexes and in a region that matches the separase cleavage site consensus. Mutations in this region abolish THR cleavage. These results indicate that THR is cleaved by the catalytic separase subunit. Expression of noncleavable THR variants results in early-embryonic lethality at lowered temperature. This lethality can be suppressed by a reduction of catalytically active separase levels, indicating that THR cleavage contributes to inactivation of separase. THR cleavage is particularly important during cellularization, an insect specific process in early-embryonic development of D.melanogaster. During cellularization the lack of separase inactivation severely disrupts organization of the tubulin-cytoskeleton. These results suggest that D. melanogaster separase has other targets in addition to cohesin subunits and might have other functions than sister chromatid separation.