Strukturbestimmung des humanen Guanylin-Prohormons zur Analyse der Rolle einer Hormon-Prosequenz und Design eines löslichen Fragments der extrazellulären Domäne der Guanylatzyklase-C

Titelangaben

Lauber, Thomas:
Strukturbestimmung des humanen Guanylin-Prohormons zur Analyse der Rolle einer Hormon-Prosequenz und Design eines löslichen Fragments der extrazellulären Domäne der Guanylatzyklase-C.
Bayreuth , 2003
( Dissertation, 2003 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Die Peptidhormone Guanylin und Uroguanylin sind als spezifische Liganden der intestinalen membrangebundenen Guanylatzyklase-C (GC-C) entscheidend an der Regulation des Flüssigkeits- und Elektrolythaushalts im Darm beteiligt. Obwohl die Rolle dieses Guanylin/GC-C Systems bei der durch die hitzestabilen bakteriellen Enterotoxine vermittelten Diarrhöe schon lange bekannt ist, kennt man bis heute keine strukturellen Details der Vorläuferproteine der GC-C-Liganden, der extrazellulären Ligandenbindungsdomäne der GC-C (GC-CECD) und der Liganden/Rezeptor-Wechselwirkung. Um zum Verständnis der biochemischen Eigenschaften des Guanylin-Prohormons beizutragen sowie den Einfluß der Prosequenz auf die Ausbildung der für die biologische Aktivität von Guanylin essentiellen Disulfidbrücken zu untersuchen, wurde in der vorliegenden Arbeit die Struktur von humanem Proguanylin bestimmt. Weiterhin wurde als Grundlage für weiterführende NMR-spektroskopische Untersuchungen der Guanylin/GC-C-Wechselwirkung ein geeignetes Fragment der GC-CECD konstruiert. Um die Strukturbestimmung von Proguanylin zu ermöglichen, wurde zunächst ein effizientes Expressions- und Reinigungsprotokoll entwickelt, das es erlaubte, Proguanylin mit der nativen Disulfidverbrückung und natürlichen biologischen Aktivität in löslicher Form zu gewinnen. Durch den Vergleich mit dem natürlichen, aus menschlichem Hämofiltrat isolierten Prohormon wurden für beide Proteine übereinstimmende biophysikalische Eigenschaften und dreidimensionale Strukturen nachgewiesen. Des Weiteren wurde mittels analytischer Sedimentationsexperimente für beide Proteine eindeutig ein monomerer Assoziationsgrad in Lösung auch bei millimolaren Konzentrationen nachgewiesen und dadurch ein früher postulierter dimerer Zustand widerlegt. Die anschließende Berechnung der dreidimensionalen Struktur von Proguanylin erfolgte durch die Verwendung von 700 aus den NMR Spektren des homogen 15N und 13C/15N markierten rekombinanten sowie des natürlichen Proteins abgeleiteten experimentellen Randbedingungen. Die Struktur von Proguanylin in Lösung stellt einen neuen Proteinfaltungstyp dar und weist drei zu einem Bündel zusammengelagerte alpha-Helices, ein kurzes, dreisträngiges, antiparalleles beta-Faltblatt sowie einen 23 Aminosäuren umfassenden unstrukturierten Bereich auf. Da das Faltblatt durch zwei N-terminale und einen C-terminalen Strang gebildet wird, kommt es zu einer unmittelbaren Nachbarschaft der Termini. Dabei wird die Hormonregion (Reste 80-94) von Proguanylin unter anderem durch die Wechselwirkungen mit dem N-terminalen Faltblattstrang in einer Guanylin A-Isomer ähnlichen Topologie stabilisiert. Diese Kontakte bewirken außerdem eine teilweise Abschirmung der ansonsten im freien Hormon zugänglichen Oberfläche und können daher die äußerst geringe Affinität bezüglich der GC-C und die damit verbundene vernachlässigbare Aktivität von Proguanylin erklären. Eine beobachtete Wechselwirkung zwischen der für die biologische Aktivität von Guanylin essentiellen Seitenkette von Tyr88 mit Arg72 leistet einen zusätzlichen Beitrag zur Inaktivierung der Hormonregion. Die Wechselwirkungen zwischen den terminalen Bereichen in der Proguanylin-Struktur scheinen außerdem für die Ausbildung der nativen Disulfidverbrückung essentiell zu sein. Eine Bestätigung dieser Annahmen wurde aus der Analyse von Proguanylin-Mutanten erhalten, die eine strukturstabilisierende Funktion der Disulfidbrücke C48-C61 nahelegt und für einen direkten Einfluß der Prosequenz auf die Struktur der Hormonregion spricht. Basierend auf einer weiteren Mutante konnte außerdem für das homologe Uroguanylin-Prohormon ein Strukturmodell erstellt werden. Für die GC-CECD wurde ein Strukturmodell erstellt, mit dessen Hilfe die Ligandenbindungsregion auf die direkte Umgebung eines exponierten und zugänglichen Faltblattstrangs kartiert werden konnte. Daher wurde für die Wechselwirkung zwischen Guanylin und der GC-CECD ein zu den intramolekularen Kontakten zwischen Guanylin und der Prosequenz ähnliches Interaktionsmotiv postuliert. Aufgrund der Größe und des Oligomerzustandes ist die GC-CECD nicht für NMR-spektroskopische Untersuchungen zur detaillierten Charakterisierung der Wechselwirkung dieses Rezeptors mit seinen Liganden geeignet. Daher wurde ein kleineres, lösliches, strukturiertes und zur Ligandenbindung fähiges Rezeptorfragment benötigt, das in Form der als miniGC-C bezeichneten membrannahen Subdomäne der GC-CECD konstruiert wurde. Dieses Fragment erfüllt die gewünschten Anforderungen und ist zur hoch affinen Bindung des Liganden STp-(5-17) in der Lage. Zur Untersuchung des zugehörigen Komplexes stellt das entwickelte Expressions- und Reinigungssystem zur Gewinnung von rekombinantem Proguanylin gleichzeitig die Grundlage für die Herstellung von homogen 15N und 13C/15N markiertem Guanylin dar, welches für zukünftige NMR-spektroskopische Untersuchungen der Wechselwirkungen zwischen Guanylin und der GC-C benötigt wird.

Abstract in weiterer Sprache

The peptide hormones guanylin and uroguanylin are involved in regulation of intestinal fluid and electrolyte secretion by specifically activating the receptor guanylyl cyclase C (GC-C). Due to its correlation with the severe secretory diarrhea caused by bacterial heat stable enterotoxins this (uro)guanylin/GC-C system is well known. However, only few structural and detailed molecular information about the precursor proteins of the endogenous ligands of GC-C, about the extracellular ligand binding domain of this receptor (GC-CECD), and the ligand/receptor interaction is available so far. In order to contribute to the understanding of the biochemical properties of the guanylin prohormone, as well as to analyse the influence of the prosequence upon formation of the disulfide bonds essential for the hormone's bioactivity the present work therefore focussed on structure determination of proguanylin. Furthermore, a fragment of the GC-CECD was designed, that is suitable for further structural studies of the guanylin/receptor interaction using NMR spectroscopy. To allow structure determination of the human prohormon proguanylin, an efficient system for the recombinant expression and purification of this protein with its native disulfide connectivity and biological activity was established. Comparison of recombinant with natural proguanylin isolated from human blood ultrafiltrate revealed identical biophysical properties and threedimensional structures for both proteins. Exhaustive analytical ultracentrifugation studies were employed for protein concentrations up to the millimolar range to determine the association state of recombinant, as well as natural proguanylin, revealing both proteins to be monomeric at the applied solution conditions, thus confuting former suggestions of proguanylin being a dimer in solution. Based on the NMR spectra of the homogeneously 15N and 13C/15N labeled recombinant protein, as well as the natural protein, a total of 700 experimental restraints could be derived that were used for structure calculation. The solution structure of proguanylin adopts a new protein fold and consists of a three helix bundle, a small three stranded beta-sheet of two NH2-terminal strands and one COOH-terminal strand, and an unstructured linker region of 23 amino acid residues. In the proguanylin structure the sequence corresponding to guanylin is fixed in its bioactive topology and is stabilized by interactions with the NH2-terminal beta-hairpin: the hormone region (residues 80-94) partly wraps around the first four NH2-terminal residues that thereby shield parts of the hormone surface. In addition to observed contacts between the side chain of Arg72 and that of Tyr88, which is essential for receptor activation, the interactions connecting the termini provide an explanation for the negligible bioactivity of the prohormone. The latter interactions also explain the important role of the NH2-terminal residues in the disulfide-coupled folding of proguanylin. Analysis of the mutant proteins proguanylin-C48S/C61S and proguanylin-C86S/C94S supports these findings and suggests an essential stabilizing function of the disulfide bond between Cys48 and Cys61 on the overall threedimensional structure, as well as a direct influence of the prosequence on the structure of the hormone region. Additionally, using the data derived from another proguanylin mutant (proguanylin-delta(28-37)) a structural model of the homologous uroguanylin precursor protein was generated. Based on the crystal structure of the extracellular domain of the homologous ANP-receptor a model structure of the GC-CECD was generated. Mapping of the known biochemical data on this structural model restricts the ligand binding region to a sequence around an exposed and accessible beta-strand located in the membrane proximal subdomain, thus implying a guanylin/receptor interaction comparable to the intramolecular interactions observed between guanylin and its prosequence. Due to its size and oligomerization state, the complete extracellular domain of GC-C is not accessable for structural studies of the interaction with its ligands guanylin, uroguanylin, and STa using NMR spectroscopy. Therefore, a smaller soluble and properly folded receptor fragment with the ability to bind these ligands was required. For this purpose, miniGC-C, a fragment corresponding to the membrane proximal subdomain was designed, featuring the mentioned properties with a binding affinity to STp-(5-17) in the nanomolar range. Finally, the established system for the recombinant expression and purification of proguanylin is a prerequisite for the production of 15N and 13C/15N labeled guanylin and thus for further NMR studies of the hormone/GC-C interaction.