Strukturbestimmung von Birkenpollenallergenen und birkenpollenassoziierten Nahrungsmittelallergenen mit NMR-Spektroskopie

Titelangaben

Neudecker, Philipp:
Strukturbestimmung von Birkenpollenallergenen und birkenpollenassoziierten Nahrungsmittelallergenen mit NMR-Spektroskopie.
Bayreuth , 2003
( Dissertation, 2003 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Das 17,4kDa schwere Hauptbirkenpollenallergen Bet v 1 ist bei mehr als 90% der Birkenpollenallergiker für die Bindung der IgE-Antikörper verantwortlich, und IgE-Kreuzreaktionen mit verwandten Proteinen wie Pru av 1 (früher Pru a 1) aus Kirschen, Gly m 4 (ursprünglich SAM22) aus Sojabohnen und Api g 1 aus Sellerie verursachen bei bis zu 70% dieser Patienten allergische Reaktionen auf Nüsse, Obst oder Gemüse. Die molekulare Grundlage für die IgE-Kreuzreaktivität zwischen Bet v 1 und Pru av 1 stellt die fast vollständige Identität ihrer Tertiärstrukturen dar. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten NMR-spektroskopischen Untersuchungen erbrachten den experimentellen Nachweis, dass der ungewöhnlich große hydrophobe Hohlraum im Innern von Pru av 1 mit Steroiden wechselwirkt. Modellierungen zeigten, dass der Hohlraum groß genug für zwei Steroidmoleküle ist, und erlaubten die Vorhersage der Komplexstruktur. Die Konformation des Proteinrückgrats von Pru av 1 wt ist in der hochaufgelösten dreidimensionalen Struktur der weniger IgE-reaktiven Mutante Pru av 1 E45W in Lösung konserviert, was zeigt, dass die Seitenkette von Glu45 an einem kreuzreaktiven IgE-Epitop beteiligt ist. Dementsprechend wurde die IgE-Bindung an Api g 1.0101 durch die Mutation K44E erhöht. Der fast vollständige Verlust der IgE-Bindung an Pru av 1 S112P ist die Folge einer Zerstörung der Tertiärstruktur. Weder die Mutation S112A noch die Deletion der COOH-terminalen Reste 155-159 beeinflusste die IgE-Bindung an Pru av 1. Die P-Schleife um Glu45 erklärt somit teilweise das klinisch beobachtete IgE-Kreuzreaktionsmuster und ortsgerichtete Mutagenese von Glu45 stellt einen Ansatz zur Entwicklung hypoallergener Varianten für die spezifische Immuntherapie dar. Als Ausgangspunkt zur Schließung der strukturellen Lücke zwischen der konstitutiv exprimierten Bet v 1-Familie von Allergenen und der verwandten stressinduzierten PR-10-Familie von mit Krankheitsbefall zusammenhängenden Proteinen wurde der Großteil der 1H-, 13C- und 15N-Resonanzen des stressinduzierten PR-10-Proteins Gly m 4 zugeordnet und eine Reihe von NOESY-Spektren aufgenommen. Die chemischen Verschiebungen, skalaren und dipolaren Kopplungskonstanten bestätigen ein auf der Grundlage von Pru av 1 und Bet v 1 erstelltes Homologiemodell, so dass die IgE-Kreuzreaktivität zwischen Bet v 1 und Gly m 4 ebenfalls auf einer praktisch identischen Tertiärstruktur beruht. Zwischen 5% und 20% der Birkenpollenallergiker zeigen IgE gegen das 9,4kDa schwere Nebenbirkenpollenallergen Bet v 4, ein Ca2+-bindendes Polcalcin. Wegen der hohen IgE-Kreuzreaktivität der Polcalcine sind viele Patienten auf Pollen verschiedenster Pflanzen polysensibilisiert. Die mit mehrdimensionaler heteronuklearer NMR-Spektroskopie bestimmte hochaufgelöste dreidimensionale Struktur von holo Bet v 4 zeigt ein kanonisches EF-Hand-Paar in der offenen Konformation. Die hochkonservierte polcalcinspezifische amphipatische COOH-terminale a-Helix deckt lediglich einen Teil der großen hydrophoben Furche auf der Moleküloberfläche von holo Bet v 4 ab. Anders als das Polcalcin Phl p 7 aus dem Wiesenlischgras, für das vor kurzem eine durch Domain Swapping entstandene dimere Struktur nachgewiesen wurde, zeigen die hydrodynamischen Parameter aus NMR-Relaxation, NMR-Translationsdiffusion und analytischer Ultrazentrifugation, dass sowohl apo als auch holo Bet v 4 vorwiegend monomer sind. Die geringere Dispersion der chemischen Verschiebungen und der etwas größere hydrodynamische Radius von apo Bet v 4 weisen auf eine reversible Änderung der Struktur bei Ca2+-Bindung hin, was die geringere IgE-Bindungsfähigkeit von apo Bet v 4 erklärt. Trotz ihrer unterschiedlichen Oligomerisierungszustände sind die Tertiärstrukturen von holo Bet v 4 und holo Phl p 7 bemerkenswert ähnlich, was eine zwanglose Erklärung für die IgE-Kreuzreaktivität liefert. Zusammen mit der engen strukturellen Homologie zu Calmodulin und der großen hydrophoben Furche auf der Moleküloberfläche weist diese Änderung der Struktur eher auf eine regulatorische denn eine Ca2+-Speicherfunktion für Bet v 4 hin. Etwa 12% der Birkenpollenallergiker zeigen IgE gegen das 34,2kDa schwere Nebenbirkenpollenallergen Bet v 6 (früher Bet v 5), das hochgradig IgE-kreuzreaktiv mit Pyr c 5 aus Birnen ist. Die Tertiärstruktur dieser Phenylcoumarin-Benzylether-Reduktasen ist noch unbekannt. Die homonuklearen NMR-Spektren von Pyr c 5 zeigen eine ausgezeichnete Dispersion der chemischen Verschiebungen, was auf eine gemischte a/b-Sekundärstruktur hindeutet. Der Ausschluss vernachlässigbarer Terme durch Einführung eines geeigneten Grenzwerts sparte einen erheblichen Teil der durch die Verwendung des gaußförmigen Datenbank-Potentials verursachten Zunahme des Rechenzeitbedarfs der Strukturberechnung dieser Allergene ein, ohne die Qualität der resultierenden Strukturen zu beeinträchtigen. Außerdem wurden mehrere Inkonsistenzen in der Standardparametrisierung der kovalenten Geometrie des Kraftfelds beseitigt.

Abstract in weiterer Sprache

The 17.4kDa major birch pollen allergen Bet v 1 is responsible for IgE antibody binding in more than 90% of birch pollinotics, and IgE cross-reaction with homologous proteins like Pru av 1 (formerly Pru a 1) from cherry, Gly m 4 (originally SAM22) from soy bean and Api g 1 from celery causes allergic reactions to nuts, fruit or vegetables in up to 70% of these patients. The molecular basis for the IgE cross-reactivity between Bet v 1 and Pru av 1 is provided by the virtual identity of their tertiary structures. The NMR spectroscopic studies carried out in this work provided experimental evidence that the unusually large internal hydrophobic cavity of Pru av 1 interacts with steroids. Molecular modelling showed that the cavity is large enough to accommodate two steroid molecules and allowed the prediction of the structure of the complex. The backbone conformation of Pru av 1 wt is conserved in the high-resolution three-dimensional structure of the less IgE reactive mutant Pru av 1 E45W in solution, demonstrating that the side-chain of Glu45 is involved in a cross-reactive IgE epitope. Accordingly, IgE binding to Api g 1.0101 was enhanced by the mutation K44E. The almost complete loss of IgE reactivity to Pru av 1 S112P is due to disruption of its tertiary structure. Neither the mutation S112A nor deletion of the COOH-terminal residues 155-159 influenced IgE binding to Pru av 1. The P-loop around Glu45 therefore partially explains the clinically observed IgE cross-reactivity pattern and site-directed mutagenesis of Glu45 is an approach to develop hypoallergenic variants for specific immunotherapy. As a starting point to bridge the structural gap between the constitutively expressed Bet v 1 family of allergens and the homologous stress-induced PR-10 family of pathogenesis-related proteins, the vast majority of the 1H, 13C, and 15N resonances of the stress-induced PR-10 protein Gly m 4 were assigned and a series of NOESY spectra acquired. The chemical shifts, scalar and dipolar coupling constants confirm a homology model of Gly m 4 created on the basis of Pru av 1 and Bet v 1, so the IgE cross-reactivity between Bet v 1 and Gly m 4 is also based on a virtually identical tertiary structure. Between 5% and 20% of birch pollinotics show IgE against the 9.4kDa minor birch pollen allergen Bet v 4, a Ca2+-binding polcalcin. Due to the high IgE cross-reactivity among the polcalcins many patients are polysensitized to various plant pollens. The high-resolution three-dimensional structure of holo Bet v 4 determined by heteronuclear multidimensional NMR spectroscopy shows a canonical two EF-hand assembly in the open conformation. The highly conserved polcalcin-specific amphipatic COOH-terminal a-helix covers only a part of the large hydrophobic groove on the molecular surface of holo Bet v 4. Unlike the pocalcin Phl p 7 from timothy grass, which was recently shown to adopt a domain-swapped dimeric structure, the hydrodynamic parameters from NMR relaxation, NMR translational diffusion and analytical ultracentrifugation indicate that both apo and holo Bet v 4 are predominantly monomeric. The reduced chemical shift dispersion and the slightly increased hydrodynamic radius of apo Bet v 4 indicate a reversible structural transition upon Ca2+ binding, which explains the reduced IgE binding capacity of apo Bet v 4. In spite of their different oligomerization states the tertiary structures of holo Bet v 4 and holo Phl p 7 are remarkably similar, thus providing a straightforward explanation for the IgE cross-reactivity. Together with the close structural homology to calmodulin and the large hydrophobic groove on the molecular surface this transistion suggests a regulatory rather than a Ca2+ buffering function for Bet v 4. About 12% of birch pollinotics show IgE against the 34.2kDa minor birch pollen allergen Bet v 6 (formerly Bet v 5), which is highly IgE cross-reactive with Pyr c 5 from pear. The tertiary structure of these phenylcoumaran benzylic ether reductases is still unknown. The homonuclear NMR spectra of Pyr c 5 show excellent chemical shift dispersion, which is indicative of a mixed a/b secondary structure. Exclusion of negligible terms by introduction of an appropriate cutoff value saved a significant portion of the increase in computing time of the structure calculation of these allergens caused by using the Gaussian conformational database potential, without affecting the quality of the resulting structures. In addition, several inconsistencies in the standard parametrization of the covalent geometry of the force field were removed.