DNA-Bindung des Transkriptionsfaktors ABF1 aus S. cerevisiae: Spezifität und Kontaktpunkte

Titelangaben

Beinoraviciute-Kellner, Rasa:
DNA-Bindung des Transkriptionsfaktors ABF1 aus S. cerevisiae: Spezifität und Kontaktpunkte.
Bayreuth , 2002
( Dissertation, 2002 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Das ABF1-Protein aus S. cerevisiae ist als ein multifunktioneller, dsDNA-bindender Transkriptionsfaktor bekannt, der nicht nur Transkriptionsprozesse in der Zelle reguliert, sondern auch an der DNA-Replikation und einer Nukleosomen-Rekonfiguration bzw. Änderung der Chromatinstruktur beteiligt ist. Da das Protein in verschiedenen Zusammenhängen immer wieder gefunden wurde, kann man davon ausgehen, dass es in den Zellprozessen eine essentielle Rolle spielt. Aus diesem Grund war es von besonderem Interesse, den zentralen Punkt der ABF1-Funktion – nämlich die Erkennung und Bindung des zugehörigen DNA-Elements – zu untersuchen und zu charakterisieren. In der vorliegenden Arbeit wurden in vitro Experimente zur Klärung dieser Fragen verwendet, wobei ein besonderes Augenmerk auf der Identifizierung der Kontaktpunkte lag. Die Experimente stützen sich auf die Literaturdaten über das spezifische DNA-Erkennungsmotiv 5’-CGTNNNNRRYGAY (konservierte Nukleotide sind unterstrichen) sowie über die strukturellen Domänen von ABF1 (Zink-Finger-Motiv, Helix-Turn-Helix-Motiv (HTH) und C-terminale Transaktivierungsdomäne). Mittels Gelretardationsexperimenten mit verschiedenen DNA-Sonden wurde gezeigt, dass ABF1 einen richtungsorientierten DNA-Bindungsmechanismus aufweist und eine Neigung zur Oligomerisierung besitzt. Die DNA-Bindungsaffinität ist stark von der Sondenlänge abhängig – die Verkürzung des DNA-Fragments von 27 auf 20 bp verringert die Bindung um eine Größenordung – , die Zusammensetzung des variablen Bereichs des Konsensusmotivs hingegen beeinflusst die Bindung nur geringfügig. Offenbar finden nur wenige ABF1-DNA-Kontakte im variablen Bereich statt, wie durch fehlgepaarte ARS1-Fragmenten nachgewiesen werden konnte. Um das ABF1-Erkennungsmotiv einzuschränken bzw. besser zu beschreiben, wurde ein in vitro DNA-Selektionsverfahren (SELEX) eingesetzt. Mit diesem Ansatz wurden zwei dsDNA-Aptamere identifiziert, die am häufigsten im selektierten DNA-Pool vorkommen und eine bis zu 20fach höhere DNA-Bindungsaffinität im Vergleich zu einem ARS1-Fragment aufweisen. Von den selektierten ABF1-Erkennungsmotive konnten die meisten im S. cerevisiae Genom wiedergefunden werden. Die Sequenzanalyse der selektierten Aptamere führte zur Erweiterung des Konsensusmotivs (5’-TACCGTATNNNATGATGT) im Vergleich zur bisher formulierten ABF1-Erkennungssequenz 5’-CGTNNNNRRYGAY. Mittels Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie wurde die ABF1-DNA-Bindungsreaktion in Bezug auf Thermodynamik und Kinetik genauer charakterisiert. Anhand der im analysierten Temperatur- (10-35°C) und Salzkonzentrationsbereich (100-300 mM NaCl) gemessenen Geschwindigkeits- und Gleichgewichtskonstanten konnten auf die Bildung von 6-7 ionischen Kontakten bei der spezifischen ABF1-ARS1-Wechselwirkung geschlossen werden. Dabei ist die Dissoziationsgeschwindigkeit sehr stark von der Ionenstärke abhängig. Die Assoziationsgeschwindigkeitskonstante kA dagegen ist nur wenig von den externen Bedingungen abhängig, zeigt aber – im Gegensatz zu kD – eine deutliche Sequenzspezifität. Aus der Temperaturabhängigkeit der thermodynamischen Parametern lässt sich schließen, dass die ABF1-DNA-Bindung bei physiologischen Temperaturen eine enthalpiekontrollierte Reaktion darstellt. In der ABF1-Struktur sind das Zink-Finger- sowie das HTH-Motiv als potenzielle DNA-Bindungsdomänen bekannt. Ein weiterer Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung der DNA-Bindedomäne sowie die Identifizierung von den DNA-kontaktierenden Aminosäuren. Dafür wurde ein 27 bp langes, I5dU-substituiertes ARS1-Fragment mit ABF1 durch UV-Bestrahlung quervernetzt. Ein limitierter Trypsin-Verdau des Quervernetzungsprodukts sowie die Ergebnisse einer chemischen Spaltung mit NTCB und Hydroxylamin legten nahe, dass nur das Zink-Finger-Motiv eine Quervernetzung mit dem untersuchten ARS1-Fragment eingeht. Die vollständige Spaltung des Quervernetzungsproduktes mit Trypsin und PDE I/II lieferte ein Peptid-Nukleotid-Addukt, das mittels MALDI-MS charakterisiert wurde. Es gelang, das Peptid NSHR aus der Zink-Finger-Region zu identifizieren, das höchstwahrscheinlich über His57 einen spezifischen DNA-Kontakt mit dem IdU-Rest an Position 8 im ARS1-Oligonukleotid bildet. Damit ist die Beteiligung des Zn-Fingers des ABF1-Proteins an der DNA-Bindung eindeutig nachgewiesen.

Abstract in weiterer Sprache

The ABF1-Protein from S. cerevisiae is known as a multifunctional transcription factor that binds to dsDNA. It is responsible not only for transcription processes in the cell but also plays a role in DNA-replication and in nucleosome remodelling or structure change of the chromatin. The protein was identified in quite a few different experiments which is a strong indication for a key function in the basic cell processes. For this reason, the central ABF1 function, i.e. the recognition and binding process to the corresponding DNA element, has been studied in vitro within the presented work. The experiments base on the literature on the specific recognition motive 5’-CGTNNNNRRYGAY (conserved nucleotides are underlined) and the structural domains of ABF1: zinc finger motive, helix turn helix motive (HTH) and C-terminated transactivation domains. Gelshift experiments with different DNA-probes revealed that ABF1 shows orientation dependent binding and that it has a tendency to oligomerization. The binding affinity strongly depends on the probe length – upon shortening the DNA fragment from 27 to 20 bp the binding constant changes by an order of magnitude – whereas variation of the base pairs in the unconserved part of the consensus motive shows no remarkable effect on the binding affinity. Together with the experiments of mismatched ARS1 fragments we can conclude that there are only very few contact points between ABF1 and the unconserved part of the DNA recognition motive. With the in vitro DNA selection method SELEX we could more specifically describe the ABF1-recognition motive. Two dsDNA-aptameres making the major fraction in the DNA pool after purification were shown to enhance the DNA binding affinity by a factor of 20 with respect to an ARS1 fragment. Most of the identified ABF1 recognition motives could be found in the genome of S. cerevisiae. A sequence analysis of the extracted aptameres led us to postulate a larger consensus motive: 5’-TACCGTATNNNATGATGT. The thermodynamic properties and the kinetics of the ABF1-DNA binding process were investigated by surface plasmon resonance spectroscopy. From the reaction and equilibrium constants in the observed temperature (10-35 °C) and salt concentration range (100-300 mM NaCl) we could estimate a number of 6 to 7 ionic contacts for the specific ABF1-ARS1 interaction. The dissociation reaction was found to strongly depend on the ion concentration. The association reaction constant kA showed only a weak dependency on the external conditions but was – in contrast to kD – highly sequence-specific. The temperature dependence of the thermodynamic reaction parameters reveals that for physiological temperatures, the binding between ABF1 and DNA is an enthalpy controlled process. Finally, by UV-induced cross-linking of a 27 bp long, I5dU-substituted ARS1 fragment with ABF1, we investigated the DNA binding domain and the contacting amino acids. The zinc finger and the HTH motive were known as possible candidates. The limited proteolysis of the cross-linked complex by trypsin and the results from a chemical cleavage reaction with NTCB and hydroxylamine indicated that only the zinc finger motive cross-links with the investigated ARS1 fragment. The complete cleavage of the cross-linked complex by trypsin and PDE I/II led to a nucleo-peptide adduct that was then further characterized by MALDI-MS. We could identify the NSHR peptide from the zinc finger region that probably builds a specific DNA contact to the IdU group at position 8 of the ARS1 oligonucleotide with its His57. With this, we proved that the zinc finger plays a key role in the DNA specific binding of the ABF1 protein.