Untersuchungen zur stimulierten GTPase von EF-Tu aus Thermus thermophilus

Titelangaben

Milovnik, Peter:
Untersuchungen zur stimulierten GTPase von EF-Tu aus Thermus thermophilus.
Bayreuth , 2002
( Dissertation, 2002 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

In dieser Arbeit konnten die Unterschiede im Mechanismus der GTP-Hydrolyse und der Hydrolyse von GTP-Analoga identifiziert werden: i) Ein gamma-Phosphoamid Derivat des GTP (MAAP-GTP) wird dabei gar nicht, ein anderes Derivat (DABP-GTP), das zusätzlich eine vicinal zum gamma-Phosphat stehende Aminogruppe trägt, 780-fach schneller als GTP durch EF-Tu hydrolysiert. ii) Die geschwindigkeitsbestimmenden Schritte der DABP-GTPase und der GTPase unterscheiden sich. Bei der GTPase ist der nuklophile Angriff, bei der DABP-GTPase ein Protontransfer, vermutlich die Protonierung des gamma-Phosphates, der langsamste Schritt der Reaktion. iii) Bei der DABP-GTPase spielt, im Gegensatz zur GTPase, keine der getesteten Aminosäuren aus dem aktiven Zentrum des EF-Tu eine wichtige Rolle bei der Hydrolyse. iv) DABP-GTPase verläuft durch eine intramolekulare Aminolyse und nicht durch einen nukleophilen Angriff eines Wassermoleküls. Diese aktive Beteiligung des DABP-GTP an seiner Spaltung stellt eine neue Art der Substrat-assistierten Katalyse dar. v) Die Analoga induzieren die GTP-gebundene Form des EF-Tu und ermöglichen die Bindung der aa-tRNA. Das bedeutet, dass eine hydrophobe Modifikation am gamma-Phosphat des GTP zu keiner bedeutenden strukturellen Änderung der Regionen des EF-Tu, die wichtig für die Interaktion mit seinen Effektoren sind, führt. Weiter wurden Cystein-Mutanten von EF-Tu, C82A/L404C und C82A/P357C, hergestellt und mit einem Coumarin-Derivat modifiziert. Eine tRNAPhe aus E. coli wurde an der acp3U47-Base mit einem Fluoreszein-Derivat modifiziert und gereinigt. Bei den, auf FRET-basierenden, Fluoreszenztitrationsexperimenten konnten die Affinitäten der fluoreszierenden EF-Tu Varianten zur Phe-tRNAPhe-X47F wegen einem starken Fluoreszenzhintergrund und dementsprechend schwachen Signal nur ungenau bestimmt werden. Das FRET-Assay konnte wegen dem kleinen Signal und seiner nicht eindeutigen Interpretation bei der Interaktion des fluoreszenzmarkierten ternären Komplexes mit dem Ribosom nicht zur kinetischen Untersuchungen der stimulierten GTPase von EF-Tu eingesetzt werden. Obwohl das FRET-Signal klein war, konnte die durch den Nukleotidaustausch bedingte Dissoziation des ternären Komplex kinetisch verfolgt werden. Es wurden zusätzlich Experimente zur Argininfinger Hypothese durchgeführt. Um die Funktion des konservierten Arginins 80 im ribosomalen Protein L12 aus T. thermophilus zu untersuchen wurde eine L12-R80A Mutante gereinigt. Das Wildtyp L12 wurde in den Ribosomen durch die R80A Mutante ersetzt. Die Fähigkeit dieser Ribosomen die intrinsische GTPase von EF-Tu zu stimulieren wurde mittels Hydrolyse von [gamma-32P]GTP geprüft. Für die Untersuchungen der Aktivierung der stimulierten GTPase wurde ein auf mant-dGTP Fluoreszenz basiertes Assay im T. thermophilus System etabliert. Die gegenüber den Wildtyp Ribosomen kleinen Unterschiede in der Rate der GTP-Hydrolyse und GTPase-Aktivierung deuten eher auf eine Rolle des L12-Arg80 bei der Bindung des ternären Komplexes an das Ribosom als bei der Katalyse der GTPase hin. Ähnlich wurde auch die Funktion der Arginine 57 und 59 aus der Effektorregion des EF-Tu untersucht. Hier wurden ebenfalls für einen Argininfinger relativ zum Wildtyp EF-Tu zu kleine Differenzen in der GTP-Hydrolyse und GTPase-Aktivierung beobachtet.

Abstract in weiterer Sprache

The differences in the mechanism of EF-Tu catalysed hydrolysis of GTP and GTP-analogues were identified in this work: i) A gamma-phosphoamide derivative of GTP (MAAP-GTP) is not hydrolysed. Another derivative (DABP-GTP), which bears an additional aminogroup vicinal to the gamma-phosphate, is hydrolysed 780-times faster than GTP by EF-Tu. ii) The rate limiting steps are different for the hydrolysis of DABP-GTP and GTP. The nucleophilic attack is in the GTPase the rate limiting step. A proton transfer, most likely the protonation of the gamma-phosphate, is the slowest step in the DABP-GTPase. iii) In contrast to the GTPase, no tested amino acid from the active site of the EF-Tu significantly affects the DABP-GTPase. iv) The DABP-GTP is cleaved by intramolecular aminolysis and not by a nucleophilic attack of a water molecule. This active participation of the DABP-GTP in its cleavage presents a new art of the substrate-assisted catalysis. v) The analogues induce the GTP-bound form of EF-Tu and make the binding of an aa-tRNA possible. This means that the hydrophobic modification of the gamma-phosphate of GTP causes no significant structural changes in the regions of EF-Tu that are important for the interaction with its effectors. Cysteine-mutants of EF-Tu, C82A/L404C and C82A/P357C, were prepared and modified with a coumarine derivative. A tRNAPhe from E. coli was labeled with a fluorescein derivative on the acp3U47-Base and purified. Weak signal in the FRET-based fluorescence titration experiments prevented a precise determination of affinity between the EF-Tu variants and the Phe-tRNAPhe-X47F. Because of the ambiguous interpretation, the FRET-assay was not used for kinetic studies of the ribosome stimulated GTPase. However, the dissociation of the ternary complex, which was promoted by the nucleotide exchange, could be analysed by the FRET-assay. Finally, the arginine-finger hypothesis of the stimulated GTP-hydrolysis was tested for three arginines. A R80A mutant of the ribosomal protein L12 was purified. Wild type L12 was exchanged for the R80A Mutant in the T. thermophilus ribosomes. The ability of these ribosomes to stimulate the intrinsic GTPase of EF-Tu was followed by the hydrolysis of the [gamma-32P]GTP. For the studies on the activation of the GTPase was a mant-dGTP fluorescence assay used in the T. thermophilus system. The small differences in the GTP-hydrolysis and GTPase-activation between the wild type and the mutant ribosomes suggest a function for the L12-Arg80 for the binding of the ternary complex to the ribosome and not for catalysis of the GTPase. In analogy, the function of arginines 57 and 59 from the effector region of EF-Tu was examined. However, the differences in GTP-hydrolysis and GTPase-activation between the wild type EF-Tu and its arginine mutants were too small for unambiguous assignment of a role of an arginine-finger for these arginines.