Charakterisierung des Replikationsproteins ORF904 des archaealen Plasmids pRN1

Titelangaben

Beck, Kirsten:
Charakterisierung des Replikationsproteins ORF904 des archaealen Plasmids pRN1.
Bayreuth , 2008
( Dissertation, 2009 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Das Plasmid pRN1 kann als Modell für die Untersuchung der DNA-Replikation im thermoacidophilen Crenarchaeon Sulfolobus genutzt werden. Ein offenes Leseraster kodiert für das Protein ORF904. Es konnte bereits gezeigt werden, dass dieses Protein eine N-terminal lokalisierte Primase/Polymeraseaktivität besitzt, sowie eine C-terminale ATPase/Helikasedomäne. Vermutlich ist ORF904 involviert in die Replikation von pRN1. Ein Ziel dieser Arbeit war die weitere Charakterisierung der Primaseaktivität von ORF904. Ein Reihe von Oligodesoxynukleotiden wurden untersucht und es konnte ein Templat identifiziert werden, welches von ORF904 für die Synthese eines Primers genutzt werden konnte. Die Primaseerkennungssequenz GTG konnte identifiziert werden und als minimales Substrat für die Synthese eines Volllängenprimers wurde 5’-N8GTGN-3’ bestimmt. Es war außerdem bekannt, dass ORF904 Ribonukleotide und Desoxynukleotide für die Primersynthese benötigt. Die Quantifizierung des Einbaus radioaktiv markierter Ribo- und Desoxynukleotide zeigte, dass der Primer aus einem initiierenden Ribonukleotid besteht, welches mit Desoxynukleotiden verlängert wird. Der Startpunkt des Primers befindet sich direkt 5’ des Erkennungsmotivs. Die Kopiergenauigkeit des Enzyms wurde untersucht, indem die Einbaurate nichtkomplementärer Nukleotide analysiert wurde. Es konnte gezeigt werden, dass die Selektivität des Enzyms bei der Auswahl des ersten Nukleotids (Ribonukleotid) gering ist und dass ATP an dieser Position bevorzugt und gegenüber allen Basen eingebaut wird. Im Gegensatz dazu kommt es beim Einbau der Desoxynukleotide extrem selten zu Misinkorporationen, die Fehlerrate beträgt hier weniger als 0,02. Die minimale Primasedomäne von ORF904 (Aminosäuren 40-370) hat eine erhöhte Affinität für DNA mit dem Erkennungsmotiv, die Dissoziationskonstante beträgt hier 225 nM, im Vergleich zu DNA mit einem Basenaustausch im Erkennungsmotiv mit einer Dissoziationskonstante von 1200 nM. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass ORF904 in der Lage ist, ein einzelsträngiges Oligodesoxynukleotid templatunabhängig zu verlängern. Diese terminale Transferaseaktivität wurde auch bei einer Reihe weiterer archaealer zellulärer und plasmidaler Primasen gefunden. Es wird vermutet, dass diese Proteine zusätzlich an DNA-Reparaturprozessen beteiligt sind. Bisher gibt es nur wenige Informationen über den Reaktionsmechanismus von Primasen. Deshalb wurde versucht, kurze DNA-Matrizen mit verschiedenen Deletionsmutanten des Proteins zu kristallisieren, um die Röntgenkristallstruktur des Komplexes zu lösen. Nur mit einer kurzen Deletionsmutante (Aminosäuren 40-370) konnten Kristalle erzeugt werden, welche allerdings keine DNA enthielten. In der Struktur zeigte sich, dass die C-terminale Subdomäne der Deletionsmutante (Aminosäuren 260-370), welche für die Primersynthese essentiell ist, ausschließlich alpha-helikal gefaltet vorliegt. Die Anordnung der beiden Subdomänen und ihre Verbindung mit einem nicht auflösbaren, flexiblem Linker führte zu der Vermutung, dass das Protein verschiedene Konformationen einnehmen kann. Dies wurde untersucht, indem eine Reihe von Aminosäuren ausgetauscht wurden und die Primaseaktivität untersucht wurde. Damit konnte gezeigt werden, dass Y352 und schwächer W314 in die Erkennung des GTG involviert sind, da eine Mutation dieser Aminosäuren zu einem Verlust der Primaseaktivität mit einem Templat mit der Erkennungssequenz führt. In weiteren Experimenten zeigte sich, dass dieser Verlust der Aktivität vermutlich auf eine Veränderung der Erkennungssequenz zurückzuführen ist, da die Proteine in der Lage waren, mit M13 DNA, welche eine Vielzahl möglicher Sequenzen enthält, einen Primer zu synthetisieren. In der Kristallstruktur liegen das vorher identifizierte aktive Zentrum und die Aminosäuren Y352 und W314 weit voneinander entfernt, aber die Ergebnisse zeigen, dass sich diese Teile des Proteins während der Primersynthese vermutlich in räumlicher Nähe befinden. Dies unterstützte die Vermutung, dass die aktive Form von ORF904 eine geschlossene Konformation einnimmt und sich von der offenen Form im Kristall unterscheidet. Um die Replikation von pRN1 genauer untersuchen zu können, wurde versucht ein in vitro Replikationssystem aufzubauen. Es gelang nicht, den Replikationsursprung von pRN1 zu identifizieren. Viele der Proteine, welche in die DNA-Replikation involviert sind, sind in Komplexen organisiert, deshalb könnten weitere Proteine, die an der Replikation von pRN1 beteiligt sind, durch die Identifizierung von Interaktionspartnern von ORF904 gefunden werden. Mit einem modifizierten ELISA-Assay wurde die Interaktion von ORF904 mit PCNA1 beobachtet, welches Teil der archaealen sliding clamp ist und mit ORF80, welches ebenfalls auf pRN1 kodiert ist. Für die Interaktion von ORF904 mit diesen Proteinen war die Anwesenheit von ATP und einem Oligodesoxynukleotid notwendig. Die Aminosäuren 371-526 von ORF904 wurden als Ort der Interaktion identifiziert.

Abstract in weiterer Sprache

The plasmid pRN1 can be used as a convenient model to study the replication of DNA in Sulfolobus species belonging to the thermoacidophilic crenarchaeota. One open reading frames on pRN1 codes for a protein which has been termed ORF904. It could be shown that ORF904 possesses an N-terminal primase/polymerase activity and a C-terminal ATPase/helicase domain. It is likely that ORF904 is extensively involved in the replication of pRN1. One of the aims of this thesis was to further characterize the primase activity of ORF904. Screening different short oligodeoxynucleotides for their ability to support primer synthesis allowed to identify one suitable defined substrate. The primase recognition sequence GTG could be determined and the minimal substrate that is still able to support the formation of a full length primer is 5’-N8GTGN-3’. It had also been observed that ORF904 requires both ribonucleotides and deoxynucleotides for the synthesis of a primer. Quantifying the incorporation of radioactively labelled ribo- and deoxynucleotides showed that the primer always consists of one initial rNTP and is elongated exclusively with dNTPs. In addition the starting point of the primer is the base 5’ of the recognition motif. The fidelity of the enzyme was tested by analysing the incorporation rate of non-cognate nucleotides. It was found that the first nucleotide (ribonucleotide) is selected with low specificity, ATP is preferred in this position and can be effectively incorporated opposite all four bases. In contrast the deoxynucleotides are very rarely misincorporated, the error rate of the enzyme is less than 0,02. The minimal primase domain of ORF904 (amino acids 40-370) shows an increased affinity for DNA with the recognition motif with a dissociation constant of 225 nM compared to 1200 nM for DNA with a single base change in the motif. Additionally it was found that ORF904 is able to elongate single stranded DNA in a template independent manner. This terminal transferase activity has also been identified for other archaeal cellular and plasmidal primases and might be a common feature of these enzymes. It was attempted to co-crystallize short DNA molecules sequence with different ORF904 deletion mutants in order to be able to solve the X-ray structure of the complex. Crystals were only obtained with a short deletion mutant (amino acids 40-370) and they did not contain any DNA. The structure showed that the C-terminal subdomain of the deletion mutant (amino acids 260-370) which is essential for primer synthesis has an entirely alpha-helical fold. The overall arrangement of the two subdomains and their observed connection with a flexible unresolved linker led to the assumption that the protein is able to undergo a conformational change upon DNA binding. This hypothesis was tested by introducing a number of single amino acid exchanges in the protein and testing the ability of the mutants to synthesize a primer. It could be shown that Y352 and to a lesser extent W314 are involved in the recognition of the GTG because mutating them causes a loss of primase activity on templates containing the recognition motif. In further experiments it could be shown that this loss of activity is likely due to a changed recognition sequence as the proteins were able to synthesize primers on single stranded M13 virus DNA which contains a large variety of possible sequences. In the obtained structure the previously identified active centre of ORF904 and the amino acids Y352 and W314 are distant but the results suggest that both parts of the protein must come in proximity to each other during the synthesis of the primer. This supports the hypothesis that the active conformation of ORF904 is closed in contrast to the open conformation observed in the crystal structure. To be able to investigate the replication of pRN1 in more detail it was attempted to set up an in vitro replication system. The replication origin of pRN1 could not be identified. Most of the proteins involved in the replication of DNA are organized in larger complexes so determining interaction partners of ORF904 might reveal other proteins that are needed for the replication of pRN1. Using a modified ELISA an interaction of ORF904 was observed with PCNA1 which is part of the archaeal sliding clamp and ORF80, a protein that is also encoded on pRN1. For these interactions the presence of ATP and an oligodeoxynucleotide was essential. The place of the interaction was mapped to the amino acids 371-526 of ORF904.