Anaerobic Carbon Monoxide Dehydrogenase: Mechanism of CO-Oxidation at the [NiFe4S4OHx] Cluster and Nickel-Processing by its ATPase CooC

Titelangaben

Jeoung, Jae-Hun:
Anaerobic Carbon Monoxide Dehydrogenase: Mechanism of CO-Oxidation at the [NiFe4S4OHx] Cluster and Nickel-Processing by its ATPase CooC.
Bayreuth , 2008
( Dissertation, 2008 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Anaerobic CO dehydrogenases (CODH) catalyze the reversible oxidation of CO to CO2 at a complex metal center containing Ni, Fe and S called cluster C. In this work, a heterologous expression system of CODHII from Carboxydothermus hydrogenoformans in E. coli and the crystal structures of CODHII in different states are reported. CO2 bridging the Ni-Fe1 site is observed in a reduced state with exogeneously supplied CO2-source, and is reductively activated by binding to cluster C. The ligand CO2 completes the square-planar coordination of the Ni ion and replaces the H2O/OH- ligand at the Fe1 ion in the other two states. The H2O/OH- ligand is replenished by a neighboring network of water molecules. Protons produced from the reversible CO oxidation are expelled through a semi-conserved histidine channel. The mutation of His96, one of four semi-conserved histidines to Asp diminished CO-oxidation activity to 2.7% of wild-type, indicating its essential role in catalysis. The structure of H96D CODHII reveals that the abolished activity is not originated from protein misfolding and/or absence of metal centers in the protein. Another variant of CODHII devoid of cluster C, but containing clusters B and D, was structurally characterized. This cluster C-missing CODHII shows an identical protein scaffold to the structure of active enzyme, and the residues coordinating the metals of cluster C display the same location as the active wild-type enzyme. From all metals of cluster C, only the Fe1 ion displays an alternative position, which appears to be the reason for the obseved cluster C heterogeneity. The structures presented in this work define the mechanism of CO oxidation/CO2 reduction at the Ni-Fe site of cluster C and show the channels that facilitate the transport of substrate/product during catalysis. The ATPase CooC1 from C. hydrogenoformans belongs to the MinD family of the SIMIBI class NTPases containing a deviant walker A motif. The protein has been proposed to participate in the maturation of cluster C of CODH (Jeon et al, 2001). As-isolated CooC1 shows monomeric state in solution with a molecular weight of 32 kDa. The presence of Ni(II) induces dimerization of CooC1, and the protein binds one Ni(II) per dimer with nanomolar affinity. The crystal structure of Metal-bound CooC1 clearly identified the conserved CXC motif as the metal-binding site, which is responsible for the dimerization. In solution, CooC1 also undergoes nucleotide-dependent dimerization and forms a stable dimer in the presence of ATP. The K8A CooC1 mutant, where Ala replaced the signature Lys is incapable of both ATP hydrolysis and ATP-dependent stable dimer formation. Compared to other structural homologues of the MinD family, the ATP-induced dimer structure of CooC1 shows a different conformation than the Ni-induced dimeric state. On the basis of biochemical data and structures of CooC1 in combination with a model of ATP-driven dimerization, a reaction cycle of CooC1 in Ni-processing for the maturation of cluster C is presented.

Abstract in weiterer Sprache

Anaerobe CO-Deydrogenasen (CODH) katalysieren die reversible Oxidation von CO zu CO2 an einem komplexen Metallzentrum, das Ni, Fe und S enthält und als Cluster C bezeichnet wird. In dieser Arbeit wird ein heterologes Expressionssystem für CODHII aus Carboxydothermus hydrogenoformans in E. coli vorgestellt sowie Kristallstrukturen von CODHII in verschiedenen Zuständen. In einem reduzierten Zustand mit einer exogen zur Verfügung gestellten CO2-Quelle wurde CO2 beobachtet, das Ni und Fe1 verbrückt und das durch die Bindung an Cluster C reduktiv aktiviert wird. Der Ligand CO2 komplettiert die quadratisch-planare Koordination des Ni-Ions und ersetzt den H2O/OH--Ligand an dem Fe1-Ion in den zwei anderen Zuständen. Der bei der Katalyse verbrauchte H2O/OH--Ligand wird stets durch ein benachbartes Netzwerk aus Wassermolekülen ersetzt. Der Ausstoß der Protonen, die bei der reversiblen CO-Oxidation produziert werden, erfolgt durch einen semikonservierten Histidinkanal. Die Mutation von His96, eines von vier halbkonservierten Histidinen, zu Asp verringerte die Aktivität der CO-Oxidation auf 2,7 % des Wildtyps, was auf eine essentielle Rolle dieser Aminosäure bei der Katalyse hindeutet. Die Struktur von H96D-CODHII zeigt, dass das Verschwinden der Aktivität nicht auf einer Fehlfaltung des Proteins und/oder auf der Abwesenheit von Metallzentren im Protein beruht. Eine andere Variante von CODHII, die nicht Cluster C, sondern nur die Cluster B und D enthält, wurde strukturell charakterisiert. Die Struktur der CODHII ohne Cluster C ist identisch mit der Struktur des aktiven Enzyms. Auch die Reste, die die Metalle von Cluster C koordinieren, befinden sich an den gleichen Positionen wie in dem aktiven Wildtypenzym. Von allen Metallen in Cluster C zeigt nur das Fe1-Ion eine alternative Position, was anscheinend der Grund für die beobachtete Heterogenität von Cluster C ist. Die Strukturen, die in dieser Arbeit vorgestellt werden, bestätigten den Mechanismus der CO-Oxidation/CO2-Reduktion am Ni-Fe1-Paar von Cluster C. Außerdem zeigen sie die Kanäle, die einen Substrat- / Produkttransfer während der Katalyse ermöglichen. Die ATPase CooC1 aus C. hydrogenoformans gehört zu der MinD-Familie aus der Klasse der SIMIBI-NTPasen, die ein abgewandeltes Walker A-Motiv enthalten. Es wurde vorgeschlagen, dass das Protein an der Reifung von Cluster C der CODH beteiligt ist (Jeon et al., 2001). Gereinigtes CooC1 liegt in Lösung als Monomer mit einem Molekulargewicht von 32 kDa vor. Die Anwesenheit von Ni(II) induziert eine Dimerisierung von CooC1, wobei das Protein ein Ni(II)-Ion pro Dimer mit nanomolarer Affinität bindet. Die Kristallstruktur von CooC1 mit gebundenem Metall identifizierte das konservierte CXC-Motiv eindeutig als Metallbindungsstelle, das für die Dimerisierung verantwortlich ist. In Lösung unterliegt CooC1 auch einer Nukleotid-abhängigen Dimerisierung. Es bildet ein stabiles Dimer in Gegenwart von ATP. Die K8A-CooC1-Mutante, bei der ein Ala das charakteristische Lys ersetzt, kann weder ATP hydrolysieren noch ATP-abhängig ein stabiles Dimer bilden. Vergleiche mit strukturellen Homologen der MinD-Familie ergaben, dass die ATP-induzierte Dimerstuktur von CooC1 eine andere Konformation besitzt als das Ni-induzierte Dimer. Auf der Basis von biochemischen Daten und Strukturen von CooC1 in Kombination mit einem Modell für die ATP-induzierte Dimerisierung, wird eine Reaktionszyklus vorgeschlagen, wie die Ni-Prozessierung in CooC1 für die Reifung von Cluster C ablaufen könnte.