Mineralized Bionanoparticle Pickering Emulsions

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Jutz, Günther:
Mineralized Bionanoparticle Pickering Emulsions.
Bayreuth , 2008
( Dissertation, 2008 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Various aspects of mineralized, bionanoparticle-stabilized Pickering emulsions were investigated in this work. Proteins (HSA, BSA, fetuin-A), protein cages (ferritin) and plant viruses (CPMV, TYMV, TMV) were employed to produce functional nanopatterned surfaces and interfaces by means of Pickering emulsions which were employed in biomimetic hydroxy apatite mineralization to produce inorganic biocompatible surfaces and hollow mineral spheres. The work accounts for the emerging interest and significant technological implications of protein and particle stabilized emulsions as well as bio-inorganic nanostructured composite materials. First, the bionanoparticles were characterized with SEC, UV-Vis, SLS, DLS, TEM and SDS-PAGE. Solutions of BSA, fetuin-A and ferritin contained aggregates and had to be fractionated with SEC for the following studies. Structural characterization of the viruses was accomplished by TEM with negative staining. Further, CPMV was labelled with fluorescein and tetramethylrhodamine. The preparation of CPMV-solutions from frozen leaves of cowpea plants is shortly described, too. Next, kinetic investigations of the adsorption process of the bionanoparticles at the decane/buffer solution interface were performed with pendant drop tensiometry. Interfacial pressure isotherms were recorded for BSA, HSA, fetuin-A, ferritin, CPMV and TYMV. A detailed explanation of the previously developed model of variable surface states of adsorbed proteins and various aspects of protein adsorption experiments were necessary as basis for the discussion and the modelling of the isotherms and the dynamic surface tension. The surface pressure isotherms of BSA and ferritin as well as the dynamic surface tension of BSA could be modelled successfully and were in excellent agreement with previous reports. Further, oil-in-water Pickering emulsions with perfluorooctane or an UV-crosslinkable PDMS precursor oil were prepared. The liquid-liquid interface could be imaged by confocal laser scanning fluorescence microscopy while the solid interfaces could be accessed with SEM and AFM. The bionanoparticles at the interface formed a dense assembly but the pattern did not show any long-range order. Interestingly, the rods of TMV formed no liquid-crystalline array but an irregular, sparse assembly at the interface. Height determinations of the adsorbed virus with AFM and TEM of cross-sections from embedded interfaces showed that TMV was not significantly immersed into the oil phase. The adsorption of BSA and ferritin could be further proven by fluorescence microscopy of solid Pickering emulsions that have reacted with fluorescently labelled antibodies. Finally, mineralization with hydroxy apatite (HAP) was conducted with various solutions under different conditions. The use of a simulated body fluid (SBF) allowed a biomimetic mineralization. A pre-incubation step on bioactive glass particles was necessary to induce HAP growth with SBF at physiological concentrations. Further, 1.5-fold concentrated SBF solution (1.5 SBF/cit) and an oversaturated calcium phosphate solution (Ca/P/cit), both containing citrate, were employed. The development of hydroxy apatite coatings on PET as model substrate was followed with time. PDMS-surfaces with immobilized proteins were used to mimic bio-related interfaces. Extensive structural and compositional characterization was performed with SEM and EDX. The induction and growth of hydroxy apatite was discussed and compared in detail for surfaces with different immobilized bionanoparticles and for different mineralization conditions. Dense coatings were achieved with SBF and Ca/P/cit. Surfaces prepared with ferritin and SDS yielded generally the smoothest and most compact HAP layers. Finally, true bionanoparticle Pickering emulsions (i.e. liquid-liquid interfaces) were used to produce mineral capsule shells. The development of the interfacial mineralization was investigated after various incubation times and exchanges of the mineralization solutions. The observed surface morphologies were explained by different mechanisms of nuclei formation and HAP growth. Particularly, the use of 1.5 SBF/cit or Ca/P/cit led to a dense pattern of single separated nuclei at the interface which tended to grow together to form compact shells. Ferritin-based Pickering emulsions were usually mineralized more weakly than BSA- and fetuin-A-based ones. In the case of Ca/P/cit, the slow mineralization of ferritin-coated oil droplets led to a controlled and very homogeneous formation of thin HAP composite shells. The combination of different mineralization mechanisms allowed the preparation of capsules with various controlled shell thicknesses and surface morphologies. Finally, the work contributes to the basic understanding of protein adsorption at liquid-liquid interfaces and their interfacial structures and shows new ways for the production of composite biomaterials through interfacial templating.

Abstract in weiterer Sprache

In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Aspekte von mineralisierten, Bionanopartikel-stabilisierten Pickering-Emulsionen untersucht. HSA, BSA, Fetuin-A, Ferritin und Pflanzenviren (CPMV, TYMV und TMV) wurden verwendet, um nanostrukturierte funktionale Ober- und Grenzflächen in Form von Pickering-Emulsionen zu erzeugen. Aus diesen wurden biokompatible, anorganische Oberflächen und Hohlkugeln durch Mineralisierung mit Hydroxyapatit hergestellt. Die Arbeit entstand aus dem Interesse und großen technologischen Relevanz von Protein- und Partikel-stabilisierten Emulsionen und nanostrukturierten Komposit-Materialien. Die Bionanopartikel und -lösungen wurden mit SEC, UV-Vis, SLS, DLS und SDS-PAGE untersucht. Die Lösungen von BSA, Fetuin-A und Ferritin enthielten aggregierte Teilchen, die für die weiteren Studien mittels SEC abgetrennt wurden. Die Pflanzenviren wurden mittels TEM und negativer Kontrastierung charakterisiert. Weiter wurde CPMV mit Farbstoffen funktionalisiert. Die Isolierung von CPMV aus gefrorenen Blättern von Augenbohnen-Pflanzen wurde ebenfalls beschrieben. Die Kinetik des Adsorptionsprozesses der Bionanopartikel an die Grenzfläche von Dekan/Puffer wurde mit der Methode des hängenden Tropfens untersucht. Die Isothermen des Grenzflächendruckes wurden für BSA, HSA, Fetuin-A, Ferritin, CPMV und TYMV aufgezeichnet. Das kürzlich entwickelte Model mit veränderlichen Grenzflächenzuständen adsorbierter Proteine und weiterer Aspekte von Protein-Adsorptionsexperimenten wurden detailliert erläutert, um die Adsorptionsexperimente und deren Modellierung kritisch diskutieren zu können. Die Grenzflächenspannungsisothermen von BSA und Ferritin sowie die dynamische Grenzflächenspannung von BSA konnten erfolgreich modelliert werden. Öl-in-Wasser-Pickering-Emulsionen wurden mit Perfluoroktan oder einem UV-vernetzbaren PDMS-Öl hergestellt. Die flüssigen Öltröpfchen konnten mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie abgebildet werden, während die vernetzten, festen PDMS-Tröpfchen mittels REM und AFM untersucht wurden. Die Bionanopartikel an der Grenzfläche bildeten eine dichte Anordnung ohne langreichweitige Ordnung. TMV bedeckte die Grenzfläche in einer dünnen und regellosen Anordnung. Die Messung der Höhe von adsorbierten Viren mittels AFM und TEM von Querschnitten eingebetteter Grenzflächen zeigte, dass TMV nicht in die Ölphase eingetaucht war. Die Adsorption von BSA und Ferritin konnte weiterhin durch Fluoreszenzmikroskopie von Pickering-Emulsionen gezeigt werden, die mit fluoreszierenden Antikörpern markiert worden waren. Schließlich wurden Mineralisierungsreaktionen mit Hydroxyapatit in verschiedenen Lösungen und unter verschiedenen Bedingungen durchgeführt. In SBF mit physiologischen Konzentrationen konnte eine biomimetische Mineralisierung erreicht werden, wenn das Substrat zuvor auf bioaktiven Glassteilchen inkubiert wurde. Des Weiteren wurde SBF mit der 1.5-fachen Konzentration (1.5 SBF/cit) und eine übersättigte Calciumphosphat-Lösung (Ca/P/cit) eingesetzt. Die Beschichtung von PET mit Hydroxyapatit wurde zu verschiedenen Zeiten untersucht. PDMS-Oberflächen mit adsorbierten Bionanopartikeln wurden benutzt, um biologisch relevante Oberflächen zu imitieren. Die Charakterisierung der Schichten wurde mit SEM und EDX durchgeführt. Die Induktion und das Wachstum der HAP-Schichten auf den verschiedenen Oberflächen und unter verschiedenen Mineralisierungsbedingungen wurden ausführlich beschrieben und verglichen. In SBF und Ca/P/cit konnten dichte HAP-Schichten erhalten werden. Oberflächen, die mit Ferritin und SDS hergestellt wurden, ergaben meist die glättesten und kompaktesten Schichten. Schließlich wurden tatsächliche Pickering-Emulsionen, d. h. Grenzflächen zwischen Flüssig-Flüssig-Phasen, verwendet, um mineralisierte Kapseln herzustellen. Das Fortschreiten der Mineralisierung an der Grenzfläche wurde nach verschiedenen Inkubationszeiten und Austausch der Mineralisierungslösungen untersucht. Die Oberflächen-Morphologien wurden durch unterschiedliche Mechanismen der Keimbildung und Wachstum der HAP-Schicht erklärt. 1.5 SBF/cit und Ca/P/cit ergaben dichte Anordnungen von einzelnen Keimen an der Grenzfläche, die fortschreitend zu kompakten Schalen zusammenwuchsen. Pickering-Emulsionen, die mit Ferritin hergestellt worden waren, wurden meist schwächer mineralisiert als solche, die mit BSA oder Fetuin-A hergestellt wurden. Im Fall von Ca/P/cit führte die langsame Mineralisierung der Ferritin-bedeckten Öltröpfchen zu einem kontrollierten Wachstum einer sehr homogenen HAP-Schicht. Durch die geschickte Kombination von verschiedenen Mineralisierungslösungen bzw. -mechanismen konnte die Bildung von Kapseln mit unterschiedlichen Dicken und Oberflächenmorphologien erzielt werden. Die Arbeit trägt zum grundlegenden Verständnis der Proteinadsorption an Flüssig-Flüssig-Grenzflächen und deren Struktur bei und zeigt neue Wege zur Herstellung von Komposit-Biomaterialien durch Grenzflächentemplate auf.