Function of the ATP-dependent Metalloprotease FtsH during sporulation in Bacillus subtilis

Titelangaben

Le, Thi Thuy Ai:
Function of the ATP-dependent Metalloprotease FtsH during sporulation in Bacillus subtilis.
Bayreuth , 2008
( Dissertation, 2008 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

The analysis of the function of the ftsH gene of Bacillus subtilis started about ten years ago. It was shown at that time that an ftsH knockout was viable, but exhibited a pleiotropic phenotype. Cells are sensitive to salt and heat shock, exhibit filamentous growth, are difficult to be transformed and are almost unable to sporulate. Despite the severe phenotype caused by the absence of the ftsH gene, the precise functions of this protein remained unclear. This PhD thesis presents data to elucidate the function of ftsH during sporulation. Furthermore, it describes the construction of a cold-inducible expression system. The major finding of this thesis is that the FtsH protease interferes with the synthesis and/or phosphorylation of Spo0A, the master regulator during initiation of sporulation called phase 0. In the ftsH knockout, the amount of Spo0A is greatly reduced, and the small amounts present are inactive. When the wild-type spo0A allele was replaced by an IPTG-inducible allele coding for mutant Spo0A protein being fully active in the absence of phosphorylation (Spo0A-Sad67), spores were formed at a normal rate in an ftsH knockout. Again, this result indicates that FtsH is clearly involved in the formation of active Spo0A and that this protease is only essential during stage 0 of sporulation. To become active, Spo0A needs to be phosphorylated by the multi-component system called phosphorelay. Since no active Spo0A is present in an ftsH knockout, it was hypothesized that FtsH has to degrade one or more negative regulator(s) either preventing the phosphorylation of Spo0A or/and being involving in its rapid dephosphorylation. The further analysis focused on four antagonists of the phosphorelay, three Rap phosphatases being involved in the dephosphorylation of Spo0F~P, and Spo0E which targets Spo0A~P. When a null allele in any one of them was combined with the ftsH knockout, the wild-type amount of Spo0A was restored only in the case of the ftsH spo0E knockout and the sporulation frequency was increased by two to three orders of magnitude in all double knockouts, but remained below 1%. Since overexpression of Spo0E reduces the sporulation frequency and removal of the gene from the genome has an opposite effect, a direct interaction between FtsH and Spo0E was envisaged. In vitro proteolysis assays with purified GST-FtsH and GST-Spo0E showed that Spo0E is indeed a target of FtsH. In contrast, the two homologs of Spo0E, YisI and YnzD, remained stable upon incubation with FtsH. Since all three proteins are distinguished by a C-terminal extension of about 25 amino acids present in Spo0E, but not in the two other phosphatases, these additional amino acids could serve as a target for FtsH. When two mutant versions of Spo0E, Spo0E94 and Spo0E11, with truncated C-terminal ends were analyzed, they turned out to be stable in the presence of FtsH. When the C-terminal 25 amino acids was transferred to YnzD, this fusion protein became unstable when incubated with FtsH. In conclusion, the C-terminal end of Spo0E confers instability to this enzyme. Since a spo0E knockout in a wild-type background does not result in a sporulation frequency close to 100% and a combination of a spo0E and an ftsH knockout raises the sporulation frequency only close to 1%, it can be concluded that there are additional targets for FtsH interfering with the synthesis of active Spo0A. Moreover, it is likely that FtsH also exerts a function late during sporulation. It could be shown that SpoVM, a small peptide essential for spore morphogenesis, inhibits the proteolytic activity of the B. subtilis FtsH protease in vitro. It can be inferred that SpoVM also inhibits activity of FtsH during sporulation, and in the absence of SpoVM, FtsH will degrade at least one protein essential for successful completion of sporulation. When the intracellular proteomes of spoVM+ and spoVM- cells were compared, a total of 83 proteins were identified being either completely absent or present in reduced amounts in the absence of the peptide. Analysis of the expression of the spoVM gene revealed that cells started to synthesize the spoVM transcript at stage 2 while the SpoVM peptide accumulated at stage 4. The 5´ untranslated region of the spoVM transcript has been identified to act as a negative regulator of its own transcription or translation. Furthermore, a cold-inducible expression system has been constructed allowing intra- and extracellular production of recombinant proteins. This expression system makes use of a two-component signal transduction system, which senses changes in the fluidity of the cytoplasmic membrane.

Abstract in weiterer Sprache

Die Analyse der Funktion des ftsH-Gens von Bacillus subtilis begann vor etwa 10 Jahren. Damals konnte gezeigt werden, dass eine ftsH Knockout-Mutante lebensfähig ist, aber über einen pleiotropen Phänotyp verfügt. Die Zellen sind Salz- und Hitze-sensitiv, wachsen filamentös, sind schwierig zu transformieren und zeigen eine stark reduzierte Sporulationsfrequenz. Trotz dieser gravierenden Phänotypen blieb die Funktion von ftsH bislang im Dunkeln. Diese Doktorarbeit präsentiert Daten, die einige Funktionen von ftsH während der Sporulation aufdecken. Außerdem wird die Konstruktion eines Kälte-induzierbaren Expressionssystems beschrieben. Das besondere Ergebnis dieser Dissertation ist der Befund, dass die FtsH Protease mit der Synthese und/oder der Phosphorylierung von Spo0A, dem Master-Regulator während der Initiation, der Phase 0, interferiert. In einer ftsH-Knockout ist die Menge an Spo0A signifikant reduziert und die geringen Mengen sind inaktiv. Wenn das Wildtyp-Allel von spo0A durch ein IPTG-induzierbares Allel ersetzt wurde, welches für ein mutantes Protein codiert, das auch in Abwesenheit von Phosphorylierung voll aktiv ist (Spo0A-Sad67), dann wurde eine Sporulationsfrequenz gemessen, die der von Wildtyp-Zellen entsprach. Aus diesem Ergebnis ist zu folgern, dass ftsH nur während der Phase 0 essentiell ist. Um Aktivität zu erlangen, muss Spo0A phosphoryliert werde, und dies geschieht durch ein Phosphorelay. Da in einer ftsH-Mutante kein aktives Spo0A nachweisbar ist, ist zu vermuten, dass FtsH einen oder mehrere negative Regulatoren abbauen muss, die entweder die Phosphorylierung von Spo0A verhindern oder an einer schnellen Dephosphorylierung beteiligt sind. Die weitere Analyse konzentrierte sich auf vier verschiedene Antagonisten des Phosphorelays, drei Rap Phosphatasen, die Spo0F~P dephosphorylieren und Spo0E, welche Spo0A~P dephosphoryliert. Wenn Null-Allele der vier Phosphatasen mit einer ftsH-Knockout kombiniert wurden, dann wurde nur im Fall von Dspo0E Wildtyp-Mengen an Spo0A detektiert. Die Sporulationsfrequenz wurde in allen vier Stämmen um 2-3 Größenordnungen erhöht gegenüber der ftsH-Knockout, blieb aber in allen Fällen unter 1%. Da eine Überexpression von Spo0E die Sporulationsfrequenz reduziert und ein spo0E-Knockout den gegenteiligen Effekt hat, wurde eine direkte Interaktion zwischen FtsH und Spo0E in Betracht gezogen. In vitro Proteolysetests mit gereinigtem GST-FtsH und GST-Spo0E ergaben, dass Spo0E abgebaut wird. Im Gegensatz dazu erwiesen sich zwei Homologe von Spo0E, YisI und YnzD, als stabil. Da alle drei Phosphatasen sich nur in ihren N-Termini unterscheiden und nur Spo0E einen um etwa 25 Aminosäurereste verlängerten C-Terminus enthält, war zu vermuten, dass dieser Anhang von FtsH als Target erkannt wird. Wenn zwei mutante Versionen von Spo0E, SpoE94 und Spo0E11, mit FtsH inkubiert wurden, erwiesen sie sich als stabil. Beide Versionen haben einen verkürzten C-Terminus. Nach Transfer des C-Terminus von Spo0E auf YnzD erwies sich dieses Fusionsprotein als instabil. Zusammengefasst ist festzustellen, dass der C-terminus von Spo0E für die Instabilität von Spo0E gegenüber FtsH verantwortlich ist. Da die Sporulationsfrequenz in einer spo0E-Knockout nicht 100% beträgt, und sie in einer spo0E ftsH Doppelknockout nur bei knapp 1% liegt, muss FtsH zusätzliche Targets erkennen, die die Synthese von aktivem Spo0A negativ beeinflussen. Darüber hinaus übt FtsH einen Einfluss in einer späten Phase der Sporulation aus. Es konnte im Verlauf der Dissertation gezeigt werden, dass SpoVM, eine kleines essentielles Peptid für die Sporen-Morphogenese, die proteolytische Aktivität der FtsH-Protease in vitro inhibiert. Daher kann davon ausgegangen werden, dass SpoVM diese Protease auch während der Sporulation hemmt und in seiner Abwesenheit FtsH eines oder mehrere Proteine abbaut, die für einen erfolgreichen Abschluss der Sporulation notwendig sind. Wenn die intrazellulären Proteome von spoVM+ und spoVM--Zellen verglichen wurden, dann konnten insgesamt 83 Proteine identifiziert werden, die in der spoVM-Knockout entweder völlig fehlten oder in reduzierten Mengen synthetisiert wurden. Eine Analyse der Expression des spoVM-Gens ergab, dass das spoVM-Transkript bereits in der Phase 2 nachzuweisen war, während das Peptid erst in der Phase 4 erschien. Es konnte eine 5 Primer nicht-translatierte Region identifiziert werden, die als negativer Regulator der eigenen Transkription oder Translation fungiert. Außerdem wurde ein Kälte-induzierbares Expressionssystem konstruiert, welches die intra- und extrazelluläre Produktion rekombinanter Proteine erlaubt. Dieses Expressionssystem basiert auf einem 2-Komponenten Signaltransduktionssystem, welches Änderungen in der Fluidität der cytoplasmatischen Membran wahrnimmt.