Characterization of Oligonucleotide Microarray Hybridization: Microarray Fabrication by Light-Directed in situ Synthesis – Development of an Automated DNA Microarray Synthesizer, Characterization of Single Base Mismatch Discrimination and the Position-Dependent Influence of Point Defects on Oligonucleotide Duplex Binding Affinities

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Naiser, Thomas:
Characterization of Oligonucleotide Microarray Hybridization: Microarray Fabrication by Light-Directed in situ Synthesis – Development of an Automated DNA Microarray Synthesizer, Characterization of Single Base Mismatch Discrimination and the Position-Dependent Influence of Point Defects on Oligonucleotide Duplex Binding Affinities.
Bayreuth , 2008
( Dissertation, 2008 , Universität Bayreuth, Fakultät für Mathematik, Physik und Informatik)

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Abstract

The present thesis focuses on nucleic acid hybridization between free-floating target sequences and complementary end-tethered oligonucleotide probes on the surface of DNA microarrays. Hybridization experiments were performed on oligonucleotide microarrays (DNA Chips) which were fabricated with an automated synthesis apparatus (developed in the framework of the present thesis). The working principle of the microarray synthesizer is based on a photochemically controlled in situ synthesis process. By means of the combinatorial approach up to 25000 different (arbitrary) probe sequences can be fabricated in parallel - starting from nucleotide building blocks (NPPOC-phosphoramidites) - directly on the surface of the microarray. Great flexibility with regard to the choice of probe sequences is achieved by use of virtual photomasks on the basis of a spatial light modulator (Digital Micromirror Device, DMD, Texas Instruments Inc.). A microscope projection photolithography system is employed to project the virtual masks (i.e. the photomask images shown on the DMD) onto the surface of the microarray substrate. Spatially controlled photodeprotection of photolabile NPPOC protective groups (followed by coupling of a further nucleotide building block) enables massively parallel synthesis of DNA probe sequences. In the automated synthesis process microarrays are routinely fabricated over night. Comparable in situ synthesis systems are currently operated only at very few institutions around the world. We first report the application of phosphorus dendrimer substrates in the in situ synthesis of DNA microarrays. With the phosphorus dendrimer functionalization we obtained superior results in regard to sensitivity, surface homogeneity, signal/background-ratio and reusability of the microarrays. We performed microarray hybridization experiments to investigate the impact of single base defects (deliberately introduced single base mismatches and single base bulges) on the binding affinity of oligonucleotide duplexes. This is particularly interesting with regard to genotyping microarrays which are increasingly employed as a molecular diagnostics tool for the detection of single nucleotide polymorphisms (SNPs). In a number of experiments we investigated the large influence of the single-defect position on duplex binding affinity. The origin of this positional dependence - which is apparently not in agreement with the (two-state) nearest-neighbor model - had not been identified so far. We discovered that the influence of the defect position is not restricted to single base mismatches but can also be observed for single base bulge defects. On the basis of the double-ended zipper model (assuming fluctuating end-domain-opening of the oligonucleotide duplex) we could reproduce the experimentally observed positional influence. Moreover, our theoretical investigations on the zipper model indicate a significant positional influence in regard to the contributions of the individual Watson-Crick nearest-neighbor pairs to the Gibbs free energy of oligonucleotide duplex formation. The present work provides for the first time a theoretical approach for the positional-dependent nearest-neighbor model (PDNN) of Zhang et al.. In the in situ synthesis process of DNA microarrays random point-mutations are introduced into the microarray probe sequences. We have shown - experimentally and by means of a numerical model - that synthesis-related defects significantly affect microarray hybridization characteristics. With regard to single base mismatch discrimination, we discovered significant differences between DNA/DNA- and RNA/DNA hybridization: experimental results indicate an improved discrimination of purine-purine mismatch base pairs in RNA/DNA-duplexes. For the experimentally observed, unexpectedly high stability of Group II single bulges we provide an explanatory approach on the basis of the zipper model. The selection of appropriate (specific and sensitive) probe sequences is of crucial importance for successful application of DNA microarray technology. Our experimental results confirm previous results which show that only a small fraction (in piecewise sections about 20-30%) of a long cRNA target sequence is available for hybridization with the complementary microarray probes. Reduced binding affinities are assumed to originate from the influence of target secondary structure. Using software tools for antisense oligonucleotide design (accounting for target accessibility) we were able to predict efficient microarray probes. We discovered evidence that mechanically stable secondary structures (e.g. double-helical sections) interfere with the microarray surface (sterical hindrance) and thus result in reduced microarray binding affinities.

Abstract in weiterer Sprache

In der vorliegenden Arbeit wurde die Hybridisierung einzelsträngiger RNA- und DNA-Target-Sequenzen mit den für die einzelnen Sequenzen spezifischen Oligonukleotid-Probe-Sequenzen auf der Oberfläche von DNA-Microarrays untersucht. Die hierbei verwendeten Oligonukleotid-Microarrays wurden mittels eines im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Microarray-Synthese-Systems auf der Basis eines automatisierten, photolithographisch kontrollierten Syntheseprozesses hergestellt: Mit Hilfe eines kombinatorischen Verfahrens wurden - ausgehend von chemisch modifizierten NPPOC-Phosphoramidit Basenbausteinen - in paralleler Weise bis zu 25000 unterschiedliche (frei wählbare) Probe-Sequenzen in situ auf dem Microarraysubstrat synthetisiert. Eine hohe Flexibilität hinsichtlich der Auswahl der Probe-Sequenzen wird durch die Verwendung virtueller Photomasken - auf der Basis eines Mikrospiegelarrays (DMD Digital Micromirror Device, Texas Intruments Inc.) - erreicht. Mittels einer Mikroskop-Projektions-Photolithographie-Konfiguration wird das Bild des Spatial Light Modulators auf die Substratoberfläche abgebildet, um die Entschützung photolabiler NPPOC-Schutzgruppen - und damit die nachfolgende Ankopplung weiterer Basenbausteine - räumlich kontrolliert zu steuern. Mit dem Microarray-Synthesizer können in einem automatisierten Prozess DNA Microarrays mit Tausenden von beliebig wählbaren Probe-Sequenzen praktisch über Nacht hergestellt werden. Vergleichbare Systeme stehen bislang nur wenigen Forschungseinrichtungen zur Verfügung. Anhand von Hybridisierungsexperimenten wurde untersucht, wie sich (gezielt eingebaute) Einzelbasen-Defekte auf die Bindungsaffinität von Oligonukleotid-Duplexen auswirken. Dies ist in Hinsicht auf die Anwendung von SNP-Microarrays interessant, die zur Detektion von Single Nucleotide Polymorphismen - genetisch bedingten Variationen einzelner Basenpaare - in zunehmenden Maße in der molekularen Diagnostik eingesetzt werden. In einer Reihe von Experimenten lag das Augenmerk auf dem starken Einfluss der Defektposition auf die Bindungsaffinität. Die Ursache dieser offensichtlich im Widerspruch zum two-state nearest-neighbor-Modell stehenden Positionsabhängigkeit konnte bislang nicht erklärt werden. Unsere Experimente zeigen erstmals, dass die Positionsabhängigkeit nicht nur bei Mismatch-Defekten sondern in vergleichbarer Stärke auch bei single bulge Defekten auftritt. Auf der Basis eines Zipper-Models des Oligonukleotid-Duplexes, bei dem eine fluktuierende partielle Denaturierung der Duplexenden angenommen wird (die auch zur vollständigen Dissoziation führen kann), konnte der experimentell beobachtete Positionseinfluss reproduziert werden. Darüber hinaus zeigen unsere theoretischen Untersuchungen (auf der Grundlage des Zipper Modells) einen signifikanten Positionseinfluss hinsichtlich der Gewichtung der einzelnen nearest-neighbor-Beiträge zur Duplexstabilität auf. Die vorliegende Arbeit liefert damit erstmals einen theoretischen Ansatz für das positional-dependent nearest-neighbor Modell (PDNN) von Zhang et al.. Verursacht durch Streulicht und andere Einflüsse werden im Verlauf der in situ Synthese zufällige Punktmutationen in den Microarray-Probe-Sequenzen generiert. Experimentell und in numerischen Modellen konnte gezeigt werden, dass diese Synthesedefekte maßgeblich die Hybridisierungseigenschaften entsprechender Microarrays beeinflussen. Eine detaillierte Analyse des Einflusses der einzelnen Mismatch-Basenpaare auf die Bindungsaffinität zeigt hinsichtlich der Mismatch-Diskriminierung signifikante Unterschiede zwischen DNA/DNA- und RNA/DNA-Hybridisierung auf, die wahrscheinlich auf unterschiedliche Duplexstrukturen zurückzuführen sind. Für die experimentell beobachtete, vergleichsweise hohe Stabilität von Group II single bulge Defekten konnte ein Erklärungsansatz auf der Basis des Zipper-Modells gefunden werden. Für die Durchführung von Microarrayexperimenten ist die Auswahl geeigneter Probe-Sequenzen mit einer hohen Bindungsaffinität hinsichtlich der dazu komplementären Target-Sequenzen von entscheidender Bedeutung. Wir konnten frühere Resultate bestätigen, wonach - vermutlich durch den Einfluss der Targetsekundärstruktur - nur ein relativ kleiner Teil (abschnittsweise etwa 20 bis 30%) einer mehrere hundert Nukleotide langen cRNA Target-Sequenz für die Hybridisierung mit den Microarray-Probes zur Verfügung steht. Auf der Grundlage eines Software Tools für das Design von Antisense-Oligonukleotiden (Berücksichtigung der Targetsekundärstruktur) konnten die experimentell bestimmten Hybridisierungseffizienzen der Microarray-Probe-Sequenzen reproduziert werden. Darüber hinaus entdeckten wir Hinweise dafür, dass mechanisch stabile Sekundärstrukturen (z.B. doppelhelikale Abschnitte) durch Wechselwirkung mit der Microarray-Oberfläche - aufgrund von sterischer Hinderung der Duplexbildung - die Bindungsaffinität herabsetzen.