P1/HC-Pro aus dem Weizenstrichelmosaikvirus als Suppressoren des RNA silencing in Weizen

Titelangaben

Sentner, Ulrich:
P1/HC-Pro aus dem Weizenstrichelmosaikvirus als Suppressoren des RNA silencing in Weizen.
Bayreuth , 2008
( Dissertation, 2008 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Die Expression von Transgenen in Weizen ist oft schwach und instabil. Dies wird auf die Fähigkeit des Weizens zurückgeführt, die Expression eingebrachter Gene durch RNA silencing vermindern zu können. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob die Expression von Transgenen und möglicherweise auch die Transformationseffizienz (d.h. Anzahl transgener Pflanzen pro verwendetem Explantat) in Weizen durch Suppressoren des RNA silencing aus pflanzlichen Viren erhöht werden kann. Einer der bekanntesten Suppressoren ist P1/HC-Pro (protein1/helper-component-proteinase) aus Potyviren (Fam. Potyviridae), dessen Wirkung in Tabak und Arabidopsis thaliana beschrieben wurde. P1/HC-Pro ist als amino-terminaler Teil des viralen Polyproteins definiert, der durch autokatalytische Spaltung in die reifen Proteine P1 und HC-Pro prozessiert wird. Die Expression von p1/hc-pro in Tabak bewirkt eine erhöhte Expression des Reportergens glucuronidase (gus), gleichzeitig allerdings auch Kümmerwuchs und Entwicklungsstörungen der transgenen Pflanzen. Analog zu dem verwendeten P1/HC-Pro des jeweiligen pathogenen Virus, nämlich Tobacco etch virus in Tabak und Turnip mosaic virus in A. thaliana, sollte untersucht werden, ob das ähnliche P1/HC-Pro aus dem Weizenstrichelmosaikvirus (WSMV, einem Tritimovirus ebenfalls aus der Familie Potyviridae) als Suppressor des RNA silencing in Weizen wirkt. Zu diesem Zweck wurden Weizenembryonen mit p1/hc-pro aus WSMV sowie gleichzeitig mit dem Reportergen green fluorescent protein (gfp), beide unter Kontrolle des konstitutiven Ubiquitin-Promotors, transformiert und die Wirkung von P1/HC-Pro auf die gfp-Expression verfolgt. In Gegenwart von P1/HC-Pro konnte im Vergleich zur Kontrolle (d.h. nur mit gfp transformierten Embryonen) eine statistisch sehr signifikante, um den Faktor zwei erhöhte gfp-Expression beobachet werden. Überraschenderweise wurde eine gleichermaßen erhöhte gfp-Expression auch in Gegenwart von P1 alleine beobachtet, nicht jedoch in Gegenwart von HC-Pro alleine. Nicht nur die Suppressorfunktion an sich scheint sich von HC-Pro aus Potyviren auf P1 aus WSMV verlagert zu haben, auch einzelne Motive von P1 scheinen eine andere Funktion erhalten zu haben. Eine Insertionsmutation des konservierten FIVRG-Motivs in P1 aus TEV bewirkt in p1/hc-pro-transgenen Tabakpflanzen beispielsweise einen attenuierten Phänotyp, ohne die Aktivität des Suppressors P1/HC-Pro bezüglich der erhöhten Expression des Reportergens gus zu beeinträchtigen. Die Zerstörung des homologen FIVMG-Motivs durch eine Insertionsmutation in P1 aus WSMV führte zu einem vollständigen Verlust der Suppressoraktivität, unabhängig davon, ob p1 alleine oder als Teil des Polyproteins P1/HC-Pro exprimiert wurde. Das FIVMG-Motiv hat vermutlich entweder eine direkte Wirkung auf die Suppressoraktivität von P1 aus WSMV oder stabilisiert die dreidimensionale Struktur einer darin involvierten Domäne. Aufgrund der schädlichen Wirkung viraler Suppressoren wie P1/HC-Pro auf die pflanzliche Entwicklung war es trotz großer Bemühungen auch an dem weltweit in der stabilen Transformation von Weizen führenden Institut, dem International Maize and Wheat Improvement Center (CIMMYT) in Mexiko, nicht möglich, konstitutiv p1/hc-pro- oder p1-exprimierende Weizenpflanzen zu erhalten. Es konnten jedoch elf transgene Weizenlinien zur Estradiol-induzierbaren Expression von p1 erhalten werden. Die beobachtete, verzögert einsetzende und gehemmte Keimung von Embryonen aus p1-transgenen Pflanzen nach Estradiol-Induktion unterstützt die Vermutung, dass der Suppressor P1 eine schädliche Wirkung auf das Wachstum der Weizenpflanzen hat. Dies könnte bei konstitutiver Expression eine Regeneration transgener Pflanzen verhindern. Des Weiteren konnte eine um bis zu dem Faktor zwei erhöhte Expression des Reportergens gus nach Estradiol-Induktion der Expression von p1 beobachtet werden. Die anhand transient und stabil transformierter Pflanzen gewonnenen Erkenntnisse unterstützen die Vermutung, dass P1 aus WSMV als Suppressor des RNA silencing in Weizen wirkt und dass das Zusammenwirken mit HC-Pro für die Aktivität des Suppressors nicht notwendig ist. Die Strategie, konstitutiv exprimierte Suppressoren zur Steigerung der Expression von Transgenen zu nutzen, scheint aufgrund schädlicher Wirkungen auf die pflanzliche Entwicklung nicht erfolgversprechend. Stattdessen könnte man an eine zeitlich begrenzte Expression im Rahmen eines induzierbaren Systems denken. Der Suppressor P1 könnte in neuen, kommerziellen Weizenkultivaren verwendet werden und dort eine hohe Expression von Transgenen zur Erhöhung der Stresstoleranz (insbesondere Trockenheits- und Salztoleranz), Pilzresistenz, Herbizidresistenz oder zur Verbesserung der Kornqualität gewährleisten. Hauptpunkte dieser Arbeit sind der Nachweis von P1 aus WSMV als neuer Suppressor des RNA silencing in Weizen und die Etablierung eines funktionellen, chemisch-induzierbaren Systems für Weizen.

Abstract in weiterer Sprache

Expression of transgenes in wheat is often weak and unstable. This is attributed to the capability of wheat to decrease the expression of introduced genes via RNA silencing. This study is devoted to investigating whether suppressors of RNA silencing from plant viruses may increase the expression of transgenes and, optionally, the transformation efficiency (i.e. number of transgenic plants per used explant) in wheat. P1/HC-Pro (protein1/helper-component proteinase) of potyviruses (family Potyviridae) is one of the best known suppressors, the effect of which has been described in tobacco and Arabidopsis thaliana. P1/HC-Pro is defined as the amino-terminal part of the viral polyprotein, which is processed by autocatalytical cleavage into the mature proteins P1 and HC-Pro. Expression of p1/hc-pro in tobacco leads, at the same time, both to an increased expression of the reporter gene glucuronidase (gus) and to reduced growth and developmental defects in transgenic plants. In an analogous approach to the use of P1/HC-Pro of the respective pathogenic virus, namely Tobacco etch virus in tobacco and Turnip mosaic virus in A. thaliana, the intention was to find out whether the similar P1/HC-Pro of Wheat streak mosaic virus (WSMV, a Tritimovirus of the same family Potyviridae) acts as a suppressor of RNA silencing in wheat. For this purpose, we transformed wheat embryos with p1/hc-pro from WSMV and, simultaneously, with the reporter gene green fluorescent protein (gfp), both under control of the constitutive Ubiquitin promoter, and observed the effect of P1/HC-Pro on gfp-expression. We observed a statistically highly significant, two-fold increase in gfp-expression as compared to the control (i.e. embryos transformed only with gfp) when P1/HC-Pro was present. Surprisingly, we observed a similar increase in gfp-expression when only P1 was present, but not when only HC-Pro was present. Not only the suppressor function as such appears to have moved from HC-Pro of potyviruses to P1 of WSMV, but also single motifs appear to have changed their function. An insertional mutation of the conserved FIVRG motif in P1 from TEV leads, for example, to an attenuated phenotype in p1/hc-pro-transgenic tobacco plants, while, at the same time, the activity of the suppressor P1/HC-Pro is not diminished with respect to the increased expression of the reporter gene gus. The destruction of the homologous FIVMG motif by an insertional mutation in P1 from WSMV led to a complete loss of suppressor activity, independently of sole expression of p1 or expression as a part of the polyprotein P1/HC-Pro. More probably, the FIVMG motif either has a direct effect on the suppressor activity of P1 from WSMV or stabilises the three-dimensional structure of a domain which is involved therein. Because of detrimental effects of viral suppressors, such as P1/HC-Pro, on plantal growth, it was not possible to obtain transgenic wheat plants which constitutively express p1 or p1/hc-pro, even though great efforts were undertaken at the International Maize and Wheat Improvement Center (CIMMYT), Mexico, the leading institute in wheat transformation world-wide. However, we were able to obtain eleven transgenic wheat lines for estradiol-inducible expression of p1. The delayed and hampered germination of embryos from p1-transgenic plants that we observed after estradiol-induction supports our assumption that the suppressor P1 has a detrimental effect on the growth of wheat plants. Thus, constitutive expression could prevent a regeneration of transgenic plants. Furthermore, we observed an increase in the expression of the reporter gene gus by as much as two-fold after estradiol induction of the expression of p1. The findings obtained with transiently and stably transformed plants support the presumption that P1 from WSMV acts as suppressor of RNA silencing in wheat and that the cooperation with HC-Pro is not necessary for the activity of the suppressor. In view of detrimental effects on plant development, the strategy of using constitutively expressed suppressors for increasing the expression of transgenes does not appear to be promising. Instead, a temporally limited expression within the scope of an inducible system should work better. The suppressor P1 could drive a high expression of transgenes in order to increase stress tolerance (in particular drought tolerance and salt tolerance), fungus resistance, herbicide resistance or ameliorate grain quality in novel, commercial wheat cultivars. The main object of this thesis is the identification of P1 from WSMV as a novel suppressor of RNA silencing in wheat and, simultaneously, the establishing of a functional, chemically inducible system in wheat.