Phosphate nutrition in the Ricinus communis L. seedling

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Tran, Dang Khoa:
Phosphate nutrition in the Ricinus communis L. seedling.
Bayreuth , 2007
( Dissertation, 2007 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Phosphate (Pi) is one of the essential macronutrients required for growth and development of plants. Pi plays an important role in various metabolic processes, such as photosynthesis, respiration, energy conservation, carbohydrate metabolism and signal transduction. Although various Pi starvation induced genes have been isolated from different plant species grown under conditions of Pi starvation, information about their functions during germination and growth of seedlings is still lacking. During germination Pi stored in the endosperm is mobilized and transported to growing organs of seedlings, thus a phosphate transporters and acid phosphatases are expected to be involved in these processes. The aim of this study was to clarify the translocation of Pi within the seedlings and to identify the involvement of phosphate transporters and acid phosphatases in the growth of seedlings. Uptake into the phloem was analyzed by incubating the cotyledons in Pi. The movement of 32P-labeled applied as an inorganic phosphate (Pi) was detected from the cotyledons to the hypocotyl, in particular to its apical hook near the cotyledons, suggesting that Pi moves from the Ricinus communis L. cotyledons through the hypocotyl via phloem and partially re-circulates in the xylem or leaks out through the roots. Therefore reducing the efflux could be as important for the plant as increasing the efficiency of the uptake mechanism. Following the Pi uptake into the roots, the translocation of 32P-labeled Pi to the cotyledons through the hypocotyl via the xylem showed that a high amount of radiotracer accumulated in the cotyledons. The accumulated Pi in the cotyledons can be retranslocated to the roots via phloem. This work describes the cloning of the phosphate transporter RcPT1 and the acid phosphatase RcPS1 genes by RT-PCR from Ricinus seedlings grown under Pi starvation conditions. Phosphate transporter RcPT1 contains an open reading frame encoding a 530 amino acid polypeptide with a calculated molecular mass of 59 kD. The expression of RcPT1 in the yeast high-affinity phosphate transporter mutant strain complemented the mutant and enhanced the cell growth significantly. Southern blot analysis showed that the RcPT1 gene is present as a single or low-copy gene in the Ricinus genome. The transcripts of RcPT1 were expressed in the endosperm, cotyledons, hypocotyl and roots during germination. In detail in situ hybridization studies revealed RcPT1 expression in the adjacent area of endosperm to cotyledon, in the phloem and in the lower epidermis of cotyledons; Immunolocalization analysis showed RcPT1 accumulation at the same sites as its mRNA. In addition, RcPT1 transcripts were also found in the phloem of hypocotyl, and the epidermis and the steles of roots. These results implicated that RcPT1 is involved in the movement of Pi from endosperms to cotyledons and the redistribution of Pi within seedlings via phloem during germination. Acid phosphatase RcPS1 shows a 747 bp open reading frame encoding a 248 amino acids polypeptide with a calculated molecular mass of 27,5 kD. The amino acid sequence of RcPS1 shares significant similarity with the acid phosphatase LePS2 from tomato and highly conserved motifs, which are typical for a member of haloacid dehalogenase and DDDD superfamilies of enzymes catalyzing a diverse number of hydrolytic and phosphotransferase reactions. The functional analysis after expression of RcPS1 in E.coli showed significant acid phosphatase activity. The high transcript level of RcPS1 in endosperms, cotyledons and roots at the first few days of germination suggested that this acid phosphatase gene might be expressed during mobilization of storage products. RcPT1 and RcPS1 mRNA are detectable in the seedlings grown under Pi starvation and Pi sufficient conditions, indicating that both genes were expressed independently from exogenous Pi supply during germination. Moreover, RcPT1 and RcPS1 were expressed in leaves, stems and roots of plants grown under Pi starvation; furthermore, in situ hybridization studies localized RcPT1 and RcPS1 mRNA in the epidermis and the stele of roots of Pi-starved plants, suggesting that these genes also play a role in response to Pi starvation. Thus, it is concluded that there are different signals regulating RcPT1 and RcPS1 expression in response to Pi starvation and during germination.

Abstract in weiterer Sprache

Phosphat (Pi) zählt zu den wesentlichen Makronährstoffen, die für die Pflanze zu deren Wachstum und Entwicklung benötigt werden. Pi spielt eine wichtige Rolle in verschiedenen metabolischen Prozessen, wie Fotosynthese, Atmung, Energieerhaltung, Kohlenhydratmetabolismus und Signaltransduktion. Obgleich verschiedene durch Phosphat-Mangel induzierte Gene von verschiedenen Pflanzenarten isoliert wurden, ist noch immer wenig bekannt bezüglich ihrer Funktionen während der Keimung und des Wachstums der jungen Pflanzen. Während der Keimung wird im Endosperm gespeichertes Pi (source) mobilisiert und zu den wachsenden Organen der Keimlinge (sinks) transportiert. Dabei wird angenommen, dass Phosphattransporter- und Saure Phosphatase-Gene in diese Prozesse mit einbezogen sind. Die vorliegende Arbeit soll dazu beitragen, die Verteilung von Pi innerhalb der Keimlinge zu erklären und die Rolle der Phosphattransporter und Sauren Phosphatasen im Wachstum der Keimlinge zu identifizieren. Die Richtung der Verteilung des als 32P-radioaktiv applizierten anorganischen Phosphats (Pi) wurde von den Keimblättern zum Hypocotyl ermittelt, besonders zum Haken des Hypokotyls nahe den Keimblättern, was nahelegt, dass Pi von den Ricinus Keimblättern über das Phloem zum Hypokotyl transportiert wird, und entweder teilweise in das Xylem rezirkuliert, oder durch die Wurzeln austritt. Folglich könnte es für die Pflanze genauso wichtig sein den Verlust über die Wurzeln zu verringern, wie die Effizienz des Aufnahmemechanismus zu erhöhen. Aufnahmeversuche von 32P-markiertem Phosphat über die Wurzel, ergaben dessen Transport in die Keimblätter durch das Hypokotyl über das Xylem, so dass sich eine große Menge von Radioaktivität in den Keimblättern angesammelt hat. Das angesammelte Pi in den Keimblättern kann dann übers Pholem in die Wurzeln zurückgeführt werden. Diese Arbeit beschreibt die Klonierung der Phosphattransporter RcPT1 und der Gene der Sauren Phosphatase RcPS1 von Ricinus Keimlingen, welche in einem Phosphatmangel-Zustand angezogen wurden. Der Phosphattransporter RcPT1 enthält ein offenes Leseraster, das ein Polypeptid von 530 Aminosäuren mit einer errechneten molekularen Masse von 59 kD kodiert. Die Expression von RcPT1 in einer Hochaffinitäts-Phosphattransporter defizienten Hefe komplementierte die Mutation und beschleunigte das Zellwachstum signifikant. Eine Southern-Blot-Analyse zeigte, dass das RcPT1-Gen einzeln oder in wenigen Kopien im Ricinus Genom vorliegt. RcPT1-Transkripte wurden während der Keimung, im Endosperm, in den Keimblättern, im Hypocotyl und in den Wurzeln nachgewiesen. Des Weiteren wurde durch in-situ Hybridisierung die Expression von RcPT1 im angrenzenden Bereich der Endosperme zu den Keimblättern; im Phloem und in der unteren Epidermis der Keimblätter aufgezeigt; die Immunolokalisations- Analyse ergab demnach eine Ansammlung von RcPT1 an den gleichen Orten wie dessen mRNA. Zusätzlich wurden Transkripte von RcPT1 auch im Phloem von Hypokotylen und Wurzel, Epidermis und Stelen gefunden. Diese Resultate implizierten eine Rolle im Transport von Pi aus dem Endosperm in die Keimblätter, sowie in der weiteren Verteilung von Pi innerhalb der Keimlinge über das Phloem. Saure Phosphatase RcPS1 besitzt ein offenes Leseraster von 747 bp, das ein Polypeptid mit 248 Aminosäuren (27.5 kD) kodiert. Die Primärstruktur von RcPS1 weist deutliche Ähnlichkeit mit der Sauren Phosphatase LePS2 der Tomate auf und enthält konservierte Motive, die typisch sind für Mitglieder der haloacid dehalogenase-Familie und für sogenannte DDDD Superfamilien, die eine verschiedene Anzahl von Hydrolyse- und Phosphotransferase Reaktionen katalysieren. Die Funktionsanalyse von RcPS1 nach Expression in E.coli ergab eine eindeutige Saure Phosphatase-Aktivität. Die starke Transkription von RcPS1 in den Endospermen, in den Keimblättern und in den Wurzeln an den ersten Tagen der Keimung lässt darauf schließen, dass das Gen dieser Sauren Phosphatase während der Mobilisierung der Speicherprodukte aktivist. RcPT1 und RcPS1 mRNA sind in Keimlingen nachweisbar, die sowohl unter Phosphatmangel als auch unter einem ausreichenden Phosphatangebot angezogen wurden. Diese Beobachtung zeigt, dass beide Gene unabhängig von der exogenen Phosphat-Versorgung während der Keimung exprimiert werden. Außerdem wurden RcPT1 und RcPS1 in Blättern, Stämmen und Wurzeln ausgewachsener Pflanzen transkribiert, die unter Phosphat-Mangel gewachsen sind. Weiterhin konnten durch in-situ Hybridisierungsstudien RcPT1 und RcPS1 mRNA in der Epidermis und in der Stele der Wurzeln an Phosphatmangel leidender Pflanzen lokalisiert werde, was nahelegt, dass diese Proteine auch in der Antwort auf Phosphatmangel eine Rolle spielen. Daraus wird gefolgert, dass unterschiedliche Signale zur Aktivierung der Expression von RcPT1 und RcPS1 existieren, welche in Form von Phosphat Mangel oder während der Keimung, auftreten.