Esterase 2-oligodeoxynucleotide conjugates as enzyme reporter for electrochemical detection of DNA and identification of bacterial species

Titelangaben

Wang, Yiran:
Esterase 2-oligodeoxynucleotide conjugates as enzyme reporter for electrochemical detection of DNA and identification of bacterial species.
Bayreuth , 2007
( Dissertation, 2007 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Electrical Chip (E-Chip) system offers a fast, sensitive and cost-effective way to detect analyte. To improve its application of nucleic acids detection, a suitable enzyme reporter is expected. Esterase 2 (EST2) from Alicyclobacillus acidocaldarius was introduced and mutated to have an accessible cysteine residue at 118th codon. This esterase was purified by a single-step affinity chromatography with trifluoromethyl ketone as a ligand and covalently conjugated to a 5’-amino modified oligodeoxynucleotide. The purified conjugate served as a reporter enzyme for electrochemical detection of nucleic acids. Being an optimal substrate, p-aminophenylbutyrate exerts maximal signal response to EST2 in E-Chip, as determined by comparison of p-aminophenyl esters with acyl chain length from two to eight carbons. An assay of 15 pM of soluble esterase 2 in 1 ml was obtained exploiting p-aminophenylbutyrate. E-Chip detection of nucleic acids requires three essential steps: immobilization of thiol-modified capture oligodeoxynucleotides onto electrode, recruiting EST2 to electrode vicinity by means of nucleic acids hybridization, and amperometric determination of p-aminophenol produced by EST2 catalytic hydrolysis of p-aminophenylbutyrate. Generally, EST2 reporter allows a detection of approximately one million molecules/0.6 mm2 electrode. EST2 covalently attached by an oligodeoxynucleotide significantly increased the ability of mismatch discrimination as compared to the streptavidin conjugated EST2. Moreover, single nucleotide mismatch in analyte could be reliably discriminated in the set-up, as demonstrated by single nucleotide mismatch in a 49-mer oligodeoxynucleotide as well as in a 510-nucleotide ssDNA. Application of E-Chip to bacterial species identification through 16S rRNA was demonstrated. Escherichia coli and Listeria innocua were easily identified as judged by signals given by rRNA hybridization with species-specific capture ODNs. This system allows a detection of 1,000 Escherichia coli cells. As a further optimization, a stem-loop structured molecular beacon with 5’-thiol and 3’-biotin modifications was synthesized and tested on the chip using EST2-streptavidin as reporter. The presence of target oligodeoxynucleotides complementary to the whole stem-loop sequence enhanced signal for a moderate 2-fold. The future work should focus on combination of continuous flow PCR with EST2-oligodeoxynucleotide conjugate reporter to do faster and more automatic disease related DNA analysis, as well as construction of EST2 based biosensor for toxic agents detection.

Abstract in weiterer Sprache

Ein elektrischer Biochip (E-Chip) ermöglicht eine schnelle, sensitive und kostengünstige Detektion von Analyten. Die Anwendung bei Nucleinsäure-Hybridisierungen bedarf aber eines geeigneten Reportersystems. Hierfür wurde Esterase 2 (EST2) von Alicyclobacillus acidocaldarius in der vorliegenden Arbeit eingeführt und für die Anwendung mutiert um ein Oberflächen-zugängliches Cystein an Position 118 zu schaffen. Das mutante EST2 Protein konnte durch Ein-Schritt-Affinitätschromatographie mit Trifluoromethylketon als Liganden gereinigt und nach kovalenter Kopplung eines Oligonukleotides an Cys118 als Reporterenzym für die elektrochemische Detektion von Nukleinsäurenhybridisierungen genutzt werden. Im Vergleich von p-Aminophenylestern mit Kettenlänge des Acylrests von zwei bis acht Kohlenstoffatomen erwies sich p-Aminophenylbutyrat als optimales Substrat, das hohe Signalstärken erzeugte. Es konnten 15 pM/1 ml EST2 nachgewiesen werden. Der Nachweis von Nucleinsäuren über einen E-Chip bedarf dreier Schritte: Immobilisierung eines Thiol-modifizierten Fänger-Oligonukleotides auf der Gold-Elektrode. Fixierung der für die enzymatische Generierung der elektrochemisch aktiven Spezies benötigten EST2 auf der Elektrode, durch Hybridisierung an die Probensequenz die wiederum an die Fängersequenz bindet. Anschließend erfolgt die amperometrische Bestimmung des durch Enzymkatalyse gebildeten p-Aminophenols aus p-Aminophenolbutyrat. Allgemein ermöglichte EST2 als Reportergruppe die Detektion von ungefähr einer Million Molekülen je 0.6 mm2 Elektrode. Das EST2-Oligonucleotidekonjugat erhöhte zudem die Detektionsschwelle einer Basenfehlpaarung im Vergleich zu einer häufiger verwendeten, aber unspezifischeren Streptavidin-konjugierten EST2. Zuverlässig wurde eine einzelne Fehlpaarung in einem 49mer wie auch einem 510-Nucleotiden langen DNA Stück nachgewiesen. Die Anwendbarkeit der in dieser Arbeit entwickelten E-Chip Methodik konnte bei der bakterielle Speziesbestimmung durch Hybridiserung an 16S rRNA-spezifischen Fängern gezeigt werden. Escherichia coli und Listeria innocua ließen sich einfach durch die Höhe des amperometrischen Signales voneinander unterscheiden. Hierzu reichten bereits 1000 Eschericia coli Zellen aus. Als weitere Optimierung wurde eine Haarnadelschleife als ‚Molecular Beacon’ mit einer 5’-Thiol und einer 3’-Biotingruppe synthetisiert und mit EST2-Streptavidin als Reporter getestet. In Gegenwart der zur Haarnadelschleife komplementären Zielsequenz erhöhte das elektrochemische Signal allerdings nur moderat um den Faktor 2. Zukünftige Arbeiten sollten die Kombination einer kontinuierlichen PCR zur Proben-Amplifikation im Chipsystem mit den EST2-Oligonucleotid-Reportern ermöglichen, um eine schnellere, voll-automatische DNA-Analyse zu ermöglichen. Ebenso wären EST2 basierte Biosensoren gegen toxische Verbindungen denkbar.