Oligosaccharid-gerichtete RNA-Aptamere

Titelangaben

Milovnikova, Maria:
Oligosaccharid-gerichtete RNA-Aptamere.
Bayreuth , 2006
( Dissertation, 2006 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Im Rahmen dieser Arbeit sollte die SELEX Methode, zur Gewinnung von RNA-Aptameren, die ausgewählte an der Membranoberfläche eukaryotischer Zellen häufig vorhandene Oligosaccharide spezifisch erkennen, etabliert werden. Zum Erreichen dieser Ziele wurden vier Oligosaccharide Gal-1,4-b-GlcNAc-1,2-Man-OR; a-Neu5Ac-2,3-b-Gal-1,4-b-GlcNAc-1,2-Man-OR; 2,4-(b-Gal-1,4-b-GlcNAc)2-a-Man-OR und 2,4-(a-Neu5Ac-2,3-b-Gal-1,4-b-GlcNAc)2-a-Man-OR mittels chemisch-enzymatischer Verfahren mit zwei unterschiedlichen Spacern synthetisiert. Die Spacer ermöglichten eine kovalente Immobilisierung der Oligosaccharide an verschiedenen Oberflächen durch eine Amino- oder Thiolgruppe. Es wurde der Einfluss der Zusammensetzung, der Größe, der Verzweigung und der Ladung der Oligosaccharide auf die Ergebnisse der in vitro Selektion unter verschiedenen Selektionsbedingungen untersucht. Die biochemischen Eigenschaften und die Bindungsspezifität von drei selektierten RNA-Aptameren 5G, 9G und 10G, die bei mehreren unabhängigen Selektionen isoliert wurden, wurden analysiert. Zur qualitativen Analyse der RNA/Oligosacharid-Interaktion wurde auch die Oberflächen-Plasmon-Resonanz- Spektroskopie benutzt. Gleichzeitig wurden die Bindungskonstanten für RNA Aptamere 5G, 9G, 10G und das Trisaccharid Gal-1,4-b-GlcNAc-1,2-Man bestimmt. Um auswertbare Resultate aus den Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Spektroskopie-Experimenten zu erhalten, mussten diese für die spezifischen Eigenschaften der Bindungspartner optimiert werden. Wahrscheinlich auch wegen der Tendenz der Aptamere zur Oligomerisierung konnte nicht eindeutig gezeigt werden, ob die selektierten Aptamere die Oligosaccharide, die auf Sepharose 6B-basierende Festphase oder beides erkennen. Dies führte zu weiteren Selektionen mit modifizierten und optimierten Bedingungen. Es hat sich gezeigt, dass man durch gezielte Variationen des Selektionsprozesses die Selektion von RNA-Aptameren gegen Oligosaccharide lenken kann. Die Selektionen lieferten neue Oligosaccharid-bindende RNA-Aptamere. Es zeigt sich, dass die Optimierung der Selektionsbedingungen für eine erfolgreiche in vitro Selektion und Gewinnung von spezifisch bindenden Aptameren wesentlich ist. Den größten Einfluss auf die Ergebnisse der Selektion hatten die Eigenschaften der Festphase, die zu der Immobilisierung der Oligosaccharide benutzt wurde.

Abstract in weiterer Sprache

The goal of this work was to establish the SELEX method, for the selection of RNA-aptamers which bind to selected oligosaccharides abundant on the surface of eukaryotic cells. Surface plasmon resonance technology (SPR) was used for the analysis of the RNA/oligosaccharide interaction. Four distinct oligosaccharides Gal-1,4-b-GlcNAc-1,2-Man-OR; a-Neu5Ac-2,3-b-Gal-1,4-b-GlcNAc-1,2-Man-OR; 2,4-(b-Gal-1,4-b-GlcNAc)2-a-Man-OR and 2,4-(a-Neu5Ac-2,3-b-Gal-1,4-b-GlcNAc)2-a-Man-OR have been synthesized using a combined chemical-enzymatic approach and have been attached to two different spacers. The spacers allowed immobilization of the oligosaccharides on various surfaces via amino- or thiol-coupling. Several selections were set up to study the influence of the composition, the dimensions, the branching and the charge state of the oligosaccharides on the outcome of the in vitro selections. Three RNA-aptamers 5G, 9G and 10G were selected in a number of independent selections. The biochemical properties and the binding specificities of these three aptamers were analyzed. Surface Plasmon Resonance Spectroscopy was used for qualitative analysis of oligosaccharide/RNA interaction. The bindings constants were determined for RNA-aptamers 5G, 9G, 10G and trisaccharide Gal-1,4-b-GlcNAc-1,2-Man. The conditions of the Surface Plasmon Resonance Spectroscopy experiments were thoroughly optimized for the properties of the binding partners in order to achieve interpretable results. Probably because of the tendency of the selected aptamers to dimerize, it was not possible to show unambiguously whether the RNA-aptamers recognize the oligosaccharides, the Sepharose 6B-based solid phase or both. Therefore, further selection experiments with modified and optimized conditions were performed. The ability to drive the selection of RNA-aptamers against the oligosaccharides through targeted variation of the selection conditions was demonstrated. These later selections yielded new RNA-aptamers not present in the previous experiments, showing the importance of the optimization. The properties of the solid phase used for the immobilization of the oligosaccharides had a major influence on the outcome of the selection.