New Applications of Fluorescence Correlation Spectroscopy in Materials Science

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Zettl, Heiko:
New Applications of Fluorescence Correlation Spectroscopy in Materials Science.
Bayreuth , 2006
( Dissertation, 2006 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

In this work we have developed new concepts for the usage of fluorescence correlation spectroscopy. A classical FCS setup was modified in such a way that fluorescent species in aqueous as well as organic environments can be studied at varying temperature. We have synthesised a set of dye-labelled polymers that served as a well-defined system to study polymer diffusion and that was used to characterise the beam path and focal volume in environments with refractive indices different from that of water. Furthermore a new method for the labelling of ionic species was developed. The adaptation of the microscope optics to non-aqueous environments was done by replacing the present microscope objective by a multi-immersion objective. Secondly, a sample chamber was developed that was not only resistant to organic solvents in all parts but also allowed temperature control of the solution. Determining diffusion coefficients of polymers in solution and their concentrations requires the exact knowledge of shape and size of the observation volume. For this purpose we have synthesised a set of polystyrenes with molecular weights ranging from 4 to 1550 kg/mol each chain being labelled with a single dye molecule. All species were anionically polymerised in order to grant a very low polydispersity and with this a high reliability in the determination of the observation volume. This concept can be transferred to other solvents and, hence, shows an easy way to calibrate fluorescence correlation microscopes to different solvents and to investigate non-aqueous solutions. Furthermore, we have shown exemplarily for polystyrene that FCS is capable of determining the crossover between the dilute and the semi-dilute concentration regime. Dye-labelled polymer chains were mixed with unlabelled polymer chains of the same length and their mobility was measured by FCS for different mixing ratios. The change of the mobilities leads to the respective overlap concentrations, which are shown to follow a scaling law in a range of molecular weights from 4 to 1550 kg/mol. This is in excellent agreement with the predictions made by Flory and Huggins. The data shown demonstrate that FCS can measure diffusion properties in ranges that were not accessible before. Another part of this work focusses on concepts to monitor the aggregation of molecules by FCS. Taking low-molecular-weight surfactants as an example it is shown that with the help of Coulomb interaction cationic surfactants can be labelled with anionic dye molecules and vice versa. Moreover, micelle formation is observed already at concentrations slightly below the critical micelle concentration found with classical methods. This findings are in excellent agreement with the predictions made by Israeliachvili in the 1990ies. Additionally, it was demonstrated that by using insoluble dye molecules, which are incorporated by the forming aggregates, aggregate formation can be followed by FCS on a single-molecule level. This procedure was shown to work in both aqueous and organic polymer solutions. The high sensitivity of FCS permitted to determine the critical aggregation concentration of Janus micelles in THF to the very low value of around 8 mg/L. No other experimental method available today is capable of determining aggregation concentrations in such a low concentration regime. In the same way the critical aggregation concentration of block copolymer polystyrene-Amylose in THF was determined. Finally, temperature-dependent correlation curves allowed the determination of reaction constants and enthalpies. This is of particular interest in biochemical contexts, as the amount of available material can be minute. Exemplarily, the binding enthalpy of an RPA protein to a single-stranded DNA strain is determined by temperature-dependent correlation curves. The modifications made to a classical FCS setup were shown to enhance the spectrum of possible applications to new experimental fields. The methods and concepts developed in the framework of this thesis are expected to play an important role in meeting future challenges of polymer physics and microbiology.

Abstract in weiterer Sprache

In dieser Arbeit wurde die Einzelmolekültechnik Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) zur Untersuchung von Polymerlösungen und für temperaturabhängige Messungen an biologischen Systemen eingesetzt. Für die Durchführung dieser Messungen war es notwendig, den zur Verfügung stehenden kommerziellen Aufbau zu modifizieren und zu erweitern. Des Weiteren sind für die Messungen neue mit Farbstoff markierte Polymere synthetisiert und eine neue Methode für die Farbstoffmarkierung von ionischen Molekülen und Aggregaten entwickelt worden. Durch den Einbau eines Spezialobjektives konnte das zur Verfügung stehende Fluoeszenzkorrelationsmikroskop so modifiziert werden, dass es für Messungen an Polymerlösungen mit sehr unterschiedlichen Brechungsindizes geeignet war. Für Messungen mit organischen Lösungsmitteln und für temperaturabhängige Studien wurde eine Probenkammer mit Temperaturregelung entwickelt. Die Materialien für die Kammer und die Verbindungen zwischen den Einzelteilen wurden so gewählt, dass sie eine hohe Widerstandfähigkeit gegen die meisten organischen Lösungsmittel aufweisen. Um aus den FCS Messungen die Diffusionskoeffizienten der Polymere und deren Konzentration zu bestimmen war eine genaue Form- und Größenbestimmung des Beobachtungsvolumens notwendig. Dafür wurde eine Reihe von Polystyrolpolymeren mit Molekulargewichten zwischen 4 und 1550 kg/mol synthetisiert, die am Ende der Kette genau ein Farbstoffmolekül tragen. Alle Polymere wurden mittels anionischer Polymerisation hergestellt, was die Polydispersität sehr gering hält und damit die Genauigkeit der Volumenbestimmung erhöht. Das in diesen Messungen eingesetzte Konzept ist auch auf andere Lösungsmittel übertragbar. Das bedeutet, dass auf diesem Weg Fluoreszenzkorrelationsmikroskope für verschiedene Lösungsmittel geeicht und so Lösungen mit ganz unterschiedlichen Brechungsindizes untersucht werden können. Ferner wurde am Beispiel von Polystyrol gezeigt, dass FCS in der Lage ist, den Übergang zwischen dem verdünnten und dem halb verdünntem Konzentrationsbereich von Polystyrollösungen zu bestimmen. Dazu wurden die farbstoffmarkierten Ketten mit nichtmarkierten Poylstyrolketten gleicher Länge gemischt und die Beweglichkeit der Ketten mittels FCS gemessen. Die Auswertung der Beweglichkeit der Ketten bei verschiedenen Mischungsverhältnissen führt zur Überlappungskonzentration. Als Ergebnis erhält man ein Skalierungsgesetz für die Überlappungskonzentration in Abhängigkeit des Molekulargewichts im Molekulargewichtsbereich von 4 bis 1550 kg/mol. Der Vergleich mit den Vorhersagen der Flory-Huggins-Theorie zeigt eine hervorragende Übereinstimmung. Dieses Experiment zeigt, dass FCS in Konzentrations- und Molekulargewichtsbereiche vordringt, die bisher nicht experimentell zugänglich waren. Schließlich wurden in dieser Arbeit Konzepte entwickelt, wie mit Hilfe von FCS die Aggregation von Molekülen verfolgt werden kann. Anhand von niedermolekularen Tensidmolekülen wurde gezeigt, dass sich durch die Coulomb Wechselwirkung kationische Tenside mit anionischen Farbstoffen und umgekehrt markieren lassen. Bereits unterhalb der mit klassischen Methoden bestimmten kritischen Mizellenkonzentration wurden mit FCS Mizellen nachgewiesen. Dieses Ergebnis bestätigt experimentell die Vorhersagen, die von Israeliachvili im Jahr 1991 getroffen wurden. Desweiteren wurde gezeigt, dass die Verwendung von unlöslichen Farbstoffmolekülen, die in sich bildende Aggregate eingelagert werden, Aggregatbildung für FCS sichtbar macht. Diese Variante wurde sowohl für wässrige als auch für organische Polymerlösungen verwendet. Durch die niedrigen Farbstoffkonzentrationen, die in FCS-Experimenten verwendet werden, konnte die Kritische Aggregationskonzentration (cac) von Janus-Mizellen in THF von ca. 8 mg/L noch bestimmt werden. Keine andere derzeit verfügbare Methode kann in einem so niedrigen Konzentrationsbereich die Aggregation von Molekülen nachweisen. Auf die gleiche Weise wurde die kritische Aggregationskonzentration des Block-Copolymer Polystyrol-Amylose in THF und die der verseiften Janus-Mizellen in Wasser bestimmt. Schliesslich erlaubt die temperaturabhängige Messung von Korrelationskurven die Bestimmung von Reaktionsenthalpien und Reaktionskonstanten. Dies ist insbesondere in der Biochemie aufgrund des äußerst geringen Materialverbrauchs sehr gefragt. In dieser Arbeit wurde mit Hilfe temperaturabhängiger FCS-Messungen die Bindungsenergie des Proteins RPA an eine Einzelstrang-DNS bestimmt. Durch die Modifizierung und Erweiterung des vorhandenen Fluoreszenzkorrelationsmikroskops und durch die Synthese neuer Polymere konnten neue Einsatzbereiche für die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie erschlossen werden. Es ist zu erwarten, dass die in dieser Arbeit entwickelten Methoden und Konzepte sowohl in der Polymerphysik als auch in der Mikrobiologie eine wichtige Rolle spielen werden.