Charakterisierung des humanen Proteins MCM8 und seiner Interaktion mit CDC45

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Holtkamp, Linda:
Charakterisierung des humanen Proteins MCM8 und seiner Interaktion mit CDC45.
Bayreuth , 2011
( Dissertation, 2011 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

In der eukaryotischen und archaealen DNA-Replikation spielen MCM-Proteine eine bedeutende Rolle. Ein heterohexamerer Komplex der Proteine MCM2-7 stellt in eukaryotischen Zellen die replikative Helikase dar, welche den DNA-Doppelstrang entwindet und so für die Replikation durch die DNA-Polymerasen zugänglich macht. In den Archaea übernimmt diese Aufgabe ein homohexamerer MCM-Komplex. Ein weiteres Mitglied der eukaryotischen MCM2-7-Familie ist MCM8. Es gibt Hinweise, dass MCM8 als homohexamere Helikase in der eukaryotischen DNA-Replikation involviert ist, die tatsächliche Funktion des Proteins ist jedoch noch weitgehend unbekannt. Durch Untersuchungen von Tumorgeweben wurde gezeigt, dass humanes MCM8 in den entsprechenden Zellen akkumuliert oder mutiert vorliegt. Dies lässt darauf schließen, dass MCM8 an der Entwicklung von Tumoren beteiligt sein könnte. Für das Verständnis der Krebsentstehung ist daher die Erforschung seiner Funktion von großer Wichtigkeit. Ziel dieser Arbeit war zunächst, ein geeignetes Expressionssystem zu etablieren, in welchem rekombinantes humanes MCM8 löslich exprimiert und aufgereinigt werden kann. Hierfür wurden Expressionsstudien in Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae sowie Sf9- und High-Five-Insektenzellen durchgeführt. In S. cerevisiae konnte keine Expression von MCM8 detektiert werden, da das Protein hier möglicherweise toxisch wirkt. In E. coli konnte MCM8 nach einer Co-Expression mit dem Chaperon E. coli Triggerfakor bei einer Expressionstemperatur von 15°C teilweise löslich exprimiert werden. In Insektenzellen konnte MCM8 sowohl in plasmidbasierter transienter Expression als auch in einer Baculovirus-basierten Expression vollständig löslich exprimiert werden. Das lösliche rekombinante MCM8 wurde mittels Affinitäts-, Heparin- sowie Ionenaustausch- chromatographie aufgereinigt und auf enzymatische Aktivität untersucht. Es war bekannt, dass die anderen MCM-Proteine eine DNA-abhängige ATPase-Aktivität besitzen, und dass diese durch die Mutation eines konservierten Lysinrests im aktiven Zentrum des Proteins ausgeschaltet werden kann. Um eine eventuelle ATPase-Aktivität MCM8 zuordnen zu können, wurde die Aktivität des Wildtyp-Proteins sowie die Aktivität der mutmaßlichen ATPase-Motiv-defekten Mutante MCM8 K460E überprüft. Weder für das in E. coli noch für das in Insektenzellen exprimierten rekombinanten Protein konnte eine ATPase-Aktivität nachgewiesen werden. Auch durch Zugabe von DNA konnte diese Aktivität nicht stimuliert werden. Dies ließ darauf schließen, dass humanes MCM8 alleine in vitro keine enzymatische Aktivität besitzt. Vermutlich benötigt MCM8 wie der MCM2-7-Komplex in vivo Cofaktoren zur Ausübung seiner Funktion. CDC45 und der GINS-Proteinkomplex gelten als essentielle Cofaktoren der Helikase MCM2-7, welche zusammen als CMG-Komplex den DNA-Doppelstrang entwinden. Wenn MCM8 als Helikase in die DNA-Replikation der eukaryotischen Zelle involviert ist, ist eine Interaktion mit CDC45 wahrscheinlich. Daher wurde in dieser Arbeit die Interaktion von MCM8 mit humanem CDC45 nach Co-Expression der rekombinanten Proteine in High Five-Insektenzellen untersucht. Hinweise auf eine Interaktion von MCM8 und CDC45 ergaben sich zunächst durch eine Co-Aufreinigung der rekombinanten Proteine Strep_MCM8 und His_CDC45 mittels Talon- und anschließender Strep-Tactin-Chromatographie, in welchen beide Proteine in beiden Aufreinigungs-schritten co-eluierten. Einen weiteren Hinweis lieferte die Co-elution der Konstrukte MCM8_H10 und CDC45 in einer Gelfiltration. Durch Immunopräzipitation von MCM8_H10 und CDC45 aus High-Five-Zellextrakten, wo beide Proteine mit dem jeweiligen Interaktionspartner co-präzipitierten, konnte gezeigt werden, dass MCM8 und CDC45 in vitro interagieren. Eine in vivo-Interaktion der beiden Proteine wurde in HeLa-Zellen untersucht. Hier ergab sich ein Hinweis auf die Interaktion durch Immunopräzipitationen von CDC45 mit einem MCM8-Antikörper aus Zellextrakten logarithmisch wachsender HeLa-Zellen. Die Untersuchung fraktionierter Zellextrakte synchronisierter HeLa-Zellen lieferte Informationen über den Zeitpunkt und den Ort der Interaktion von MCM8 und CDC45 im Zellzyklus. Es ist bekannt, dass die Proteine MCM2-7 vor allem zu Beginn der Synthese-Phase chromatingebunden vorliegen. Hier konnte gezeigt werden, dass MCM8 und CDC45 gegen Ende der Synthese-Phase und am Übergang der G2- zur Mitose-Phase verstärkt chromatingebunden vorliegen. Dies lässt darauf schließen, dass das humane MCM8 eher in die Elongation als in die Initiation der eukaryotischen DNA-Replikation involviert ist. Es ist ebenfalls denkbar, dass MCM8 eine bisher noch nicht untersuchte regulatorische Funktion besitzt. Die tatsächliche Rolle von MCM8 im eukaryotischen Zellzyklus bleibt weiterhin unklar, bedarf jedoch gerade im Hinblick auf seinen potenziellen Wert als Tumor-Marker weiterer Aufklärung.

Abstract in weiterer Sprache

MCM-Proteins play an important role in the replication of DNA in Eukarya and Archaea. A heterohexameric complex, composed of the proteins MCM2-7 is known to be the replicative helicase of eukaryotic cells that unwinds the double-stranded DNA and thus makes it accessible for replication by the DNA-Polymerases. In Archaea this action is performed by a homohexameric MCM-complex. Another member of the MCM2-7 protein family is MCM8. There is evidence that MCM8 acts as a homohexameric helicase in eukaryotic DNA replication, but the exact function of the protein is widely unknown. By examination of several tumor tissues it has been shown that human MCM8 accumulates or is mutated in a variety of tumor cells. This leads to the conclusion that in these cases MCM8 may be involved in the development of tumors. To contribute to the understanding of the development of cancer, the function of MCM8 has to be explored. The first aim of this study was to establish a heterologous expression system to express soluble human MCM8 protein for purification. To achieve this, the prokaryotic system Escherichia coli and the eukaryotic systems Saccharomyces cerevisiae as well as Sf9 and High Five insect cells were tested. In S. cerevisiae no expression of MCM8 could be detected due to a probable toxic effect of the protein. In E. coli expression of soluble protein could be achieved by coexpression of E. coli trigger factor at an expression temperature of 15°C. In insect cells soluble MCM8 could be obtained via plasmid-based transient expression as well as baculovirus-mediated expression. Soluble recombinant MCM8 was purified by affinity-, heparin- and ion-exchange-chromatography and was tested for enzymatic activity. It is known that MCM-proteins exhibit DNA-dependent ATPase-activity and that this activity can be abolished by mutation of a conserved Lysine residue inside the active site of the protein. To assign a potential ATPase-activity to MCM8, the activities of the wild-type protein as well as that of the putative ATPase-deficient mutant MCM8 K460E were analyzed. An ATPase-activity could neither be shown for MCM8 expressed in E. coli nor MCM8 expressed in insect cells. Also ATPase activity could not be stimulated by addition of single-stranded or double-stranded DNA. This lead to the conclusion that MCM8 alone has no enzymatic activity in vitro. Presumably MCM8 needs the assistance of a co-factor to execute its function in vivo. CDC45 and the GINS-protein complex are regarded to be essential co-factors for the MCM2-7 helicase. These proteins together form the CMG-complex and unwind double-stranded DNA. If MCM8 acts as a helicase in eukaryotic DNA replication, it is likely that it interacts with CDC45. In this work, the interaction of MCM8 and CDC45 was explored after expression of the recombinant proteins in High Five insect cells. Indications for the interaction of MCM8 and CDC45 were obtained by co-purification of the recombinant proteins Strep_MCM8 and His_CDC45 via Talon- and Strep-Tactin-chromatography. Here both proteins co-eluted in both purification steps. To verify this interaction, gel filtration of the recombinant constructs MCM8_H10 and CDC45 was performed. Here both proteins co-eluted as well, which was another hint for their interaction. In immunoprecipitation experiments of MCM8_H10 and CDC45 from High Five cell extracts both proteins co-precipitated with the respective interaction partner. Here it could be shown that MCM8 and CDC45 interact in vitro. An in vivo-Interaction of MCM8 and CDC45 was investigated in HeLa cells. An indication of the in vivo-interaction of MCM8 and CDC45 was given by the immunoprecipitation of CDC45 with an anti-MCM8 antibody from cell extracts of logarithmically growing HeLa cells. Information about the time of the interaction of MCM8 and CDC45 in the human cell cycle and localization of the proteins inside the cell was obtained by analysis of fractionated cell extracts of synchronized HeLa cells. It is known that the MCM2-7 proteins are bound to chromatin in the early Synthesis-phase due to their essential role in the initial unwinding of chromosomal DNA for replication. Here it could be shown that chromatin binding of MCM8 and CDC45 occurs mainly in the late S-Phase and at G2/M-Phase transition, whereas most chromatin binding of MCM2 was detected in the early S-phase, as expected. This leads to the conclusion, that human MCM8 might be involved in elongation and not in initiation of DNA replication. Because no in vitro activity could be shown for MCM8, it is also possible that MCM8 exhibits another, not yet explored regulatory function. The exact role of MCM8 in the eukaryotic cell cycle remains unclear, but with regard to its potential usefulness as a tumor marker further investigation of the MCM8 function is required.