Molekulare und physiologische Charakterisierung des Energiestoffwechsels von Nitrosomonas europaea

Titelangaben

Gilch, Stefan:
Molekulare und physiologische Charakterisierung des Energiestoffwechsels von Nitrosomonas europaea.
Bayreuth , 2010
( Dissertation, 2010 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Die lösliche Ammoniak-Monooxygenase (AMO) aus Nitrosomonas europaea ist in ungefähr der gleichen Menge wie die membrangebundene AMO vorhanden. Beide Formen sind in vivo aktiv und besitzen eine ähnliche spezifische Aktivität. Die lösliche AMO ist ein Cu-, Fe- und möglicherweise auch Zn-haltiges Enzym und besteht aus den Untereinheiten AmoA (27 kDa), AmoB (42 kDa) und Cytochrom c1 (24 kDa). Das Enzym weist dabei eine heterotrimere Alpha3-Beta3-Gamma3-Untereinheitenstrukur mit einer molekularen Masse von etwa 316 kDa auf. Die AmoB-Untereinheit der löslichen AMO besitzt dabei eine Signalsequenz von 25 Aminosäuren. Die An- beziehungsweise Abwesenheit des Signalpeptides könnte die Konformation der AMO so weitreichend beeinflussen, dass daraus sowohl ein löslicher als auch ein membrangebundener AMO-Komplex resultiert. Das gereinigte Enzym koordiniert in vitro 9,5 Cu-, 3,9 Fe- und 0,45 bis 2,6 Zn-Atome. Nach Reduktion der löslichen AMO werden im Absorptionsspektrum die für Cytochrome des c-Typs charakteristischen Absorptionsbanden ersichtlich. Elektronspinresonanz-Spektren von luftoxidierter löslicher AMO bei einer Temperatur von 50 K weisen auf die Existenz von ein oder mehreren Typ-2-Cu(II)-Zentren hin. Bei einer Temperatur von 10 K wird sowohl ein für Häm-gebundenes Eisen als auch ein für nicht Häm-gebundenes Eisen charakteristisches Signal ersichtlich. Durch Vergleich der Cu(II)-Konzentration mit dem Gesamtgehalt an Cu konnte ermittelt werden, dass die lösliche AMO etwa sechs paramagnetische Cu(II)-Atome und drei diamagnetische Cu(I)-Atome koordiniert. Der substratanaloge kompetitive Hemmstoff Acetylen wird von der löslichen AMO zu einem Keten oxidiert. Dieses reaktive Intermediat bindet in der Folge kovalent an His 191 (AmoA). Die Bindung von Keten setzt dabei ein Cu(I)-Atom pro AmoA-Untereinheit frei und führt somit zu einer irreversiblen Hemmung der AMO. His 191 aus AmoA ist dementsprechend an der Koordination eines Cu(I)-Zentrums beteiligt welches die Oxidation von Ammoniak katalysiert. Die lösliche AMO katalysiert die Disproportionierung von Hydroxylamin zu Ammoniak, Nitrit und Nitrat nach folgender Reaktionsgleichung: 3,2 NH2OH + 2 NH3 + 0,8 NO3– --> 0,4 NO2– + 3,6 H+ + 2,4 e– Die Reaktion besitzt das Temperaturoptimum zwischen 45 und 50 °C, das pH-Optimum bei einem pH-Wert von 8,5 und wird weder von Licht noch von Sauerstoff beeinflusst. Die maximale spezifische Aktivität der Disproportionierung liegt bei etwa 1.000 nmol NH2OH (mg AMO)-1 min-1 und der Km-Wert für Hydroxylamin beläuft sich auf ungefähr 140 µM. Acetylen besitzt keinen Einfluss auf die Aktivität der Disproportionierung, jedoch wirkt Hydrazin als kompetitiver Hemmstoff für die Umsetzung von Hydroxylamin durch die lösliche AMO. Eine Disproportionierung von Hydroxylamin konnte auch bei intakten Nitrosomonas-Zellen beobachtet werden, welche so einer Akkumulation von Hydroxylamin entgegenwirken. Es ist denkbar, dass die Disproportionierung von Hydroxylamin einen Mechanismus darstellt, mittels dessen sich N. europaea vor toxischen Hydroxylaminkonzentrationen schützt und dabei gleichzeitig ihr Substrat Ammoniak zurückgewinnt. Weiterhin gelang es im Zuge dieser Arbeit die Existenz eines funktionellen Ammoniaktransporters vom Rhesus-Typ (Rh1) in N. europaea zu beweisen. Der passive Rh1-Transporter ermöglicht sowohl die Aufnahme von Ammoniak als auch von Methylammonium (MA) in das Cytoplasma von N. europaea. Die Menge an transportiertem MA korreliert dabei mit der Expression von Rh1. Der Km-Wert für MA beträgt dabei 1,8 mM bei einem pH-Wert von 7,25. Die Aufnahme von MA konnte vollständig durch Ammonium gehemmt werden [Ki(NH4+) = 0,3 mM]. Ein niedriger periplasmatischer pH-Wert (pH 5 - 6) während der Ammoniakoxidation scheint eine Akkumulation von Ammonium im Periplasma zu bewirken („Säurefalle“) und Rh1 ermöglicht in der Folge einen raschen Konzentrationsausgleich von NH3 mit dem Cytoplasma. In aerob Ammoniak-oxidierenden Nitrosomonas-Zellen korrelieren die spezifische Aktivitäten der Ammoniakoxidation, der Reduktion von Nitrit, als auch die Wachstumsrate mit den Transkriptionsintensitäten der zugehörigen Gene amoA/hao/rh1, nirK/norB und cbbL/ftsZ. Die Konzentration von amoA-, hao-, rh1-, coxA-, cbbL, ftsZ- und sodB-mRNA in anaerob Ammoniak-oxidierenden Nitrosomonas-Zellen war im Bezug auf aerob Ammoniak-oxidierende Nitrosomonas-Zellen reduziert, die Konzentration an nirK- and norB-Transkript dagegen aber erhöht. Während anaerober Denitrifikation (Pyruvat dient als Substrat) stieg die Transkription der Gene nirK, norB, aceE, gltA, und odhA deutlich an. Die Konzentrationen von amoA-, hao-, rh1-, coxA-, cbbL-, ftsZ- und sodB-mRNA war im Vergleich zu aerob und anaerob Ammoniak-oxidierenden Nitrosomonas-Zellen allerdings signifikant erniedrigt.

Abstract in weiterer Sprache

For the first time a soluble functional form of ammonia monooxygenase (AMO) was described in Nitrosomonas europaea in addition to its membrane-bound form. Soluble and membrane-bound AMO occur in about the same amounts in vivo and both forms are catalytically active. Soluble AMO has a molecular mass of about 316 kDa and is a Cu-, Fe- (heme and non-heme Fe), and probably Zn-containing enzyme composed of the subunits AmoA (27 kDa), AmoB (42 kDa), and cytochrome c1 (24 kDa) with an alpha3-beta3-gamma3 subunit arrangement. Soluble AMO contains 9.5 Cu-, 3.9 Fe- and 0.45 to 2.6 Zn-atoms. Upon reduction the visible absorption spectrum of AMO reveals absorption bands characteristic of cytochrome c. Electron paramagnetic resonance spectroscopy of air-oxidized AMO at 50 K shows a paramagnetic signal originating from Cu(II) and at 10 K a paramagnetic signal characteristic of heme-Fe and non-heme-Fe, respectively. Comparison of EPR-detectable Cu(II) with total copper determined by inductively coupled plasma-mass spectrometry (ICP-MS) shows that there are six paramagnetic Cu(II) and three diamagnetic Cu(I) per heterotrimeric soluble AMO (two paramagnetic and one diamagnetic Cu per protomer). Inactivation of soluble AMO with acetylene did neither diminish the Fe-signals nor the intensity of the Cu-EPR signal. The observation that a 25 amino acid signal peptide is cleaved from the membrane-bound form of the enzyme, but not from the soluble form of AMO leads to the assumption that this N-terminal peptide alters folding of AMO resulting in a soluble and a membrane-bound conformation. The specific mechanism-based inactivator acetylene is oxidized by AMO to ketene which binds at His 191 of AmoA. Upon ketene binding one Cu(I)-atom is liberated from the AmoA subunit. Apparently the combination of ketene binding and Cu(I) liberation irreversible inactivates AMO. The results give evidence that His 191 contributes to the coordination of an active Cu(I) containing catalytic center involved in ammonia oxidation. Soluble AMO catalyzes a disproportion of hydroxylamine to ammonia, nitrate, and nitrite according to following chemical equation: 3.2 NH2OH + 2 NH3 + 0.8 NO3– --> 0.4 NO2– + 3.6 H+ + 2.4 e– The reaction has a temperature optimum at 45 to 50°C, a pH optimum at 8.5, and is not effected by light or oxygen. The maximum specific activity is about 1,000 nmol NH2OH (mg AMO)-1 min-1 and the Km(NH2OH) value is about 140 µM. Acetylene does not inhibit hydroxylamine disproportion, but hydrazine acts as competitive inhibitor of the enzyme. Hydroxylamine disproportion takes place in intact bacteria at increased hydroxylamine concentration and counteracts hydroxylamine accumulation during the sequential ammonia oxidation by AMO and hydroxylamine oxidoreductase. Hydroxylamine disproportion by soluble AMO might have its function as a mechanism to detoxify hydroxylamine and to partially regenerate the substrate ammonia. In this perspective, hydroxylamine disproportion contributes to a regulation of inorganic N-metabolism and energy conservation in N. europaea. Furthermore, this study provides functional and physiological evidence for a Rhesus-type ammonia transporter (Rh1) in N. europaea. Rh1 supports ammonia as well as methylammonium (MA) uptake in the cytoplasm and the transport activities correlate with the Rh1 expression. The Km value for the MA uptake is 1.8 mM (pH 7.25), and the uptake was competitively inhibited by ammonium [Ki(NH4+) = 0.3 mM at pH 7.25]. Rh1 equilibrates the uncharged substrate species (NH3) and a low pH value (between 5 and 6) in the periplasmic space during ammonia oxidation seems to be responsible for the ammonium accumulation functioning as an acid NH4+ trap. In aerobically ammonia-oxidizing cells of N. europaea, the specific activities of ammonia oxidation, nitrite reduction, and the growth rates correlated with the transcription level of the corresponding genes amoA/hao/rh1, nirK/norB, and cbbL/ftsZ. In anaerobically ammonia-oxidizing cells of N. europaea, the cellular mRNA concentrations of amoA, hao, rh1, coxA, cbbL, ftsZ, and sodB were reduced compared with aerobically nitrifying cells, but the mRNA levels of nirK, and norB were significantly increased. During anaerobic pyruvate-dependent denitrification, the mRNA abundance of nirK, norB, aceE, gltA, and odhA was increased, while the concentrations of amoA, hao, rh1, coxA, cbbL, ftsZ, and sodB were significantly reduced.