Foamy Virus Enzymes - Activity, Regulation and Resistance

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Hartl, Maximilian J.:
Foamy Virus Enzymes - Activity, Regulation and Resistance.
Bayreuth , 2010
( Dissertation, 2010 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Foamy viruses or spumaretroviruses belong to the family of retroviridae but differ in several aspects from other retroviruses (orthoretroviruses). Viral particles contain DNA not RNA. The Pol protein, the precursor of the viral enzymes, is translated from a separate mRNA independently of the capsid and matrix proteins. The protease remains covalently bound to the reverse transcriptase, while in orthoretroviruses the protease is cleaved off autocatalytically. Thus, in mature spumaretroviruses a protease-reverse transcriptase protein (PR-RT) with three different catalytic activities is found: proteolysis, DNA polymerization and RNase H activity. In this work, the recombinant PR-RTs from the prototype foamy virus and a simian foamy virus isolate from macaques were purified and compared. The biophysical and enzymatic properties of the two enzymes were similar. However, their behavior towards the nucleoside inhibitor azidothymidine is different. This nucleoside analog inhibits the replication of foamy viruses by terminating polymerization. Prototype foamy virus was not able to develop resistance against azidothymidine, but we succeeded in the generation of an azidothymidine-resistant simian foamy virus. Up to four mutations within the reverse transcriptase were found to be necessary to confer high resistance against azidothymidine. To characterize the mechanism of resistance, the corresponding recombinant PR-RTs were investigated in vitro. The data reveal that the azidothymidine resistance is based on the excision of the incorporated inhibitor in the presence of ATP. Retroviral proteases are only active as homodimers. In this work, analysis of the PR-RT of prototype foamy virus and simian foamy virus isolated from macaques by analytical ultracentrifugation and size exclusion chromatography indicate, that foamy virus proteases are stable and inactive monomers in solution. The three-dimensional structure of the simian foamy virus protease domain was determined by nuclear magnetic resonance spectroscopy and revealed the typical folding of a monomer subunit of retroviral proteases. Furthermore, nuclear magnetic resonance analysis by paramagnetic relaxation enhancement suggested the formation of transient protease homodimers under native conditions. Finally, it is shown that polypurine rich sequences of the foamy virus RNA are able to activate protease activity. Chemical analysis of the secondary structure of these RNA sequences indicated a characteristic hairpin loop structure. Retardation and protein crosslinking experiments prove the formation of stable PR-RT dimers in the presence of the polypurine RNA sequences. Based on these in vitro data we propose a model for foamy virus assembly.

Abstract in weiterer Sprache

Foamy Viren oder Spumaretroviren gehören zur Familie der Retroviridae, unterscheiden sich jedoch deutlich von allen übrigen Retroviren (Orthoretroviren). Das Genom in infektiösen Viren besteht aus DNA und nicht aus RNA. Zudem wird Pol, das Vorläuferprotein der viralen Enzyme, von einer eigenen mRNA unabhängig von Capsid- und Matrix-Proteinen translatiert. Schließlich bleibt die virale Protease mit der Reversen Transkriptase verbunden, während sich die Proteasen von Orthoretroviren selbst abspalten. Gereifte Spumaretroviren enthalten somit ein Protease-Reverse Transkriptase (PR-RT) Protein, das drei katalytische Aktivitäten vereint: Proteolyse, DNA Polymerisation and RNase H Aktivität. In dieser Arbeit wurden rekombinante PR-RTs von zwei verschiedenen Foamy Viren (dem Prototyp Foamy Virus und dem Simian Foamy Virus aus Makaken) gereinigt und miteinander verglichen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass sich die enzymatischen Aktivitäten und die biophysikalischen Eigenschaften der beiden Proteine ähneln. Sie unterschieden sich jedoch bezüglich ihres Resistenzverhaltens gegenüber Azidothymidin. Dieser Nukleosidinhibitor ist in der Lage die Replikation von Foamy Viren zu hemmen, indem er die DNA Polymerisation terminiert. Während Prototyp Foamy Viren keine Resistenz gegen Azidothymidin entwickelten, gelang es, Azidothymidin-resistente Simian Foamy Viren zu isolieren. Vier Mutationen im Bereich der Reversen Transkriptase wurden identifiziert, die für diese Resistenz verantwortlich sind. Um den molekularen Mechanismus der Resistenz aufzuklären, wurden die entsprechenden rekombinanten PR-RT-Enzyme in vitro analysiert. Es wurde nachgewiesen, dass die Resistenz der Viren auf der Fähigkeit beruht, den bereits eingebauten Inhibitor mit Hilfe von ATP wieder zu entfernen. Obwohl retrovirale Proteasen nur als Homodimere aktiv sind, zeigten analytische Ultrazentrifugation und Größenausschlußchromatographie, dass die PR-RTs des Simian Foamy Virus aus Makaken und des Prototyp Foamy Virus in Lösung als inaktive Monomere vorlagen. Die dreidimensionale Struktur der separaten Protease-Domäne des Simian Foamy Virus wurde durch Kernspinresonanzspektroskopie bestimmt. Sie weist die typische Faltung einer Monomeruntereinheit anderer retroviraler Proteasen auf. Darüber hinaus belegten Messungen paramagnetischer Relaxationsverstärkungen der Protease-Domäne mittels Kernspinresonanzspektroskopie die Ausbildung von transienten Homodimeren. Diese Arbeit zeigt weiterhin, dass bestimmte purinreiche RNA-Sequenzen der Foamy Viren in der Lage sind, die Protease zu aktivieren. Chemische Analysen der entsprechenden RNA-Sekundärstrukturen deuteten auf die Ausbildung von charakteristischen Haarnadelschleifen-Strukturen hin. Retardations- und chemische Proteinquervernetzungsexperimente bewiesen zudem die Ausbildung von stabilen PR-RT Dimeren in Gegenwart dieser RNA-Sequenzen. Auf Grundlage der vorgestellten in vitro Experimente wird ein Modell für den Ablauf des Zusammenbaus der Viruspartikel von Foamy Viren vorgeschlagen.