Regulated intramembrane proteolysis in the control of the Bacillus subtilis anti-sigma factor RsiW.

Titelangaben

Heinrich, Janine:
Regulated intramembrane proteolysis in the control of the Bacillus subtilis anti-sigma factor RsiW.
Bayreuth , 2010
( Dissertation, 2010 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

Volltext

Link zum Volltext (externe URL):

Abstract

The activity of the extracytoplasmic function (ECF)-sigma factor SigW of the Gram-positive soil bacterium Bacillus subtilis is modulated by a specific membrane-bound anti-sigma factor (RsiW). Initiated most likely by cell wall stress, RsiW is degraded by the mechanism of regulated intramembrane proteolysis (RIP). This process involves two site-specific proteolytic cleavage events in the extracytoplasmic part (site-1) and in the transmembrane domain (site-2) of RsiW. In consequence, SigW is released to interact with the RNApolymerase, and the transcription of SigW-controlled genes is initiated. In general, regulation of differential gene expression by RIP seems to play a major role in prokaryotic stress responses, pathogenesis and antibiosis. However, in most cases the molecular basis is not understood. The main objective of this work was to use B. subtilis SigW/ RsiW as a model to investigate the mechanism of RIP in detail. In particular, there are significant differences to the inducing stress-signal and the site-1 protease that are described for the well investigated Escherichia coli ECF sigma factor SigE-system. The basis of this work were different mutants with a defect in RIP of RsiW that were isolated in a transposon screen. First, PrsW (formerly YpdC) was identified as the site-1 protease. It belongs to a superfamily of potential membrane embedded metalloproteases (MEM) with so far unknown function in bacteria. Further characterization of PrsW in a reconstituted E. coli system showed that PrsW cleaves RsiW in a site-specific manner to form a protein truncated for 40 C-terminal extracytoplasmic amino acid residues. The tail specific protease Tsp was shown to further degrade the extracytoplasmic part of this RsiW site-1 cleavage product, which is crucial for subsequent RasP catalyzed site-2 clipping. Several other peptidases seem to be involved in trimming of RsiW downstream of PrsW and upstream of RasP in B. subtilis. Second, the transposon screen revealed that a defect of the ABC-transporter EcsAB impairs RsiW site-2 cleavage by RasP for unknown reasons. It is conceivable that an EcsAB substrate competitively inhibits RasP activity. In summary, a new model of two proteolytic modules involved in intramembrane proteolysis of RsiW could be established. Each module consists of a site-specific processing peptidase (site-1: PrsW, site-2: RasP) that subjects cleaved RsiW to degradation by unspecific proteases (site-1: Tsp-like, site-2: Clp-proteases).

Abstract in weiterer Sprache

Die Aktivität des ECF Sigmafaktors SigW des Gram-positiven Bodenbakteriums Bacillus subtilis wird durch den membrangebundenen anti-Sigmafaktor (RsiW) reguliert. Stresssignale der Umwelt, welche vermutlich die Integrität der Zellhülle beeinflussen, initiieren den Abbau von RsiW. Dieser Prozess, auch als regulierte intramembrane Proteolyse (RIP) bezeichnet, umfasst zwei spezifische proteolytische Schnitte im extracytoplasmatischen Teil (Site-1) und in der Transmembrandomäne (Site-2) von RsiW. Daraus resultiert die Freisetzung von SigW und durch Wechselwirkung mit der RNA-Polymerase wird die Transkription SigW-abhängiger Gene initiiert. Die Regulation der differentiellen Genexpression durch RIP scheint bei Prokaryonten eine signifikante Rolle bei Stressantworten, der Pathogenität und der Abwehr antimikrobieller Komponenten zu spielen. Die molekulare Grundlage ist jedoch in den meisten Fällen nicht verstanden. In dieser Arbeit wurde das SigW / RsiW System aus B. subtilis als Modell verwendet, um den Mechanismus der RIP im Detail zu untersuchen. Offensichtlich liegen signifikante Unterschiede zum induzierenden Stresssignal und der Site-1 Proteolyse im Vergleich zu dem gut untersuchten ECF Sigmafaktor SigE-System aus Escherichia coli vor. Grundlage dieser Arbeit war ein Transposon-Screen, mit dem Mutanten mit einem Defekt der RIP von RsiW isoliert worden waren. Zunächst wurde PrsW, früher als YpdC bezeichnet, als die Site-1 Protease identifiziert. PrsW gehört zu einer Superfamilie von potentiellen membran-integrierten Metalloproteasen (MEM), denen in Bakterien bisher keine Funktionen zugewiesen werden konnten. Die weitere Charakterisierung von PrsW in einem rekonstituierten E. coli-System zeigte, dass RsiW sequenzspezifisch um 40 C-terminale Aminosäuren verkürzt wird. Die ‚Tail-specific protease‘ Tsp baut den restlichen extracytoplasmatischen Teil von Site-1 geschnittenem RsiW ab, was für die nachfolgende Site-2 Prozessierung durch RasP entscheidend ist. In B. subtilis scheinen verschiedene andere Peptidasen an der weiteren Verkürzung von Site-1 geschnittenem RsiW beteiligt zu sein. Ferner konnte durch den Transposon-Screen gezeigt werden, dass ein Defekt des ABC-Transporters EcsAB die Site-2 Proteolyse von RsiW durch RasP aus unbekannten Gründen verhindert. Es ist anzunehmen, dass ein Substrat von EcsAB die Aktivität von RasP kompetitiv inhibiert. Zusammenfassend ermöglichten die Ergebnisse dieser Arbeit ein neues Modell zu entwickeln. Der Abbau von RsiW durch RIP erfolgt in zwei proteolytischen Modulen. Jedes besteht aus einer Sequenz-spezifischen Peptidase (Site-1: PrsW, Site-2: RasP) die verkürztes RsiW dem weiteren Abbau durch unspezifische Proteasen (Site-1: Tsp-ähnliche, Site-2: Clp-Proteasen) zugänglich macht.