Identification and characterization of Sgo2 interactions - Insights into dynamic chromosomal localization, mechanism of cohesin protection and putative checkpoint function

Titelangaben

Mayer, Bernd:
Identification and characterization of Sgo2 interactions - Insights into dynamic chromosomal localization, mechanism of cohesin protection and putative checkpoint function.
Bayreuth , 2010
( Dissertation, 2010 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Sister chromatids are embraced and held together by a ring-shaped multiprotein complex called cohesin, from the time of their generation in S-phase until their separation in M-phase. Shugoshins protect centromeric cohesin from premature dissociation and, hence, are important regulators of genome stability. This work demonstrates that hSgo2, one of the two shugoshins in humans, first binds to kinetochores in prophase, then localizes to centromeres in prometaphase before finally traveling back to kinetochores in metaphase. It is further shown that (1) chromatin binding requires the C-terminus of hSgo2, (2) the catalytic activity of the aurora B kinase is essential to focus hSgo2 at centromeres, and (3) attachment of microtubules to kinetochores is not only necessary for the metaphase-specific re-localization of hSgo2 but also sufficient; pulling forces are not required. These newly discovered regulations allow to formulate a mechanistic model that explains shugoshin’s dynamic subcellular localization. An existing conflict in the literature concerns the relative importance of mammalian Sgo1 and Sgo2 in mitosis. Cell biological analyses now demonstrate unambiguously that, contrary to earlier claims, hSgo2 is dispensable for several aspects of mitotic cell divisions. Thus, shugoshin functions are strictly separated, being fulfilled by hSgo1 in mitosis and by hSgo2 in meiosis. Initially, it was unclear how shugoshins exert their cohesin protective function at the molecular level. Using a biochemical approach, protein phosphatase 2A (PP2A) was identified as a prominent interactor of shugoshins in this thesis. Shortly thereafter, it was reported that shugoshins protect cohesin by mediating PP2A-dependent dephosphorylation. Nevertheless, it is shown here for the first time that hSgo2 binds PP2A via its N-terminus. A Sgo2 point mutant deficient in PP2A binding is created and characterized by cell biological experiments. Importantly, biochemical assays demonstrate that hSgo2 greatly stimulates PP2A’s enzymatic activity. Shugoshin function therefore extends beyond simple provision of a linkage between cohesin and PP2A. Mitosis and meiosis are chiefly controlled by the spindle assembly checkpoint (SAC), which allows anaphase to take place only after all chromosomes have become properly attached to the mitotic spindle. Central to SAC signaling, kinetochore bound Mad1-Mad2 complex catalyzes a conformational switch of soluble Mad2, thereby allowing its inhibitory binding to the downstream effector protein Cdc20. SAC-dependent inhibition of anaphase correlates well in timing with shugoshin-dependent protection of cohesin. Here, Mad2 is identified as another novel interactor of hSgo2. Precise mapping reveal a conserved Mad2 interaction motif (MIM) in hSgo2, which is shared by the known Mad2 interactors Mad1 and Cdc20. In fact, several lines of evidence show that the Sgo2-Mad2 complex is structurally very similar to the Mad1-Mad2 and the Cdc20-Mad2 complexes. These biochemical studies challenge the current “one source (kinetochore bound Mad1) – one target (Cdc20)” dogma in the field of SAC research. Mad2 binding is conserved in the only Xenopus laevis shugoshin, xSgo1, indicating an important function of this interaction during vertebrate meiosis.

Abstract in weiterer Sprache

DNA-Replikation in S-Phase und Chromosomensegregation in Mitose sind im Zellzyklus getrennte Ereignisse. Die Identität der jeweiligen Schwesterchromatiden wird durch den ringförmigen Kohäsin-Multiproteinkomplex sichergestellt, der die beiden DNA-Stränge umschließt. Shugoshin-Proteine verhindern die vorzeitige Dissoziation von Kohäsin und tragen somit entscheidend zur genomischen Integrität bei. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass hSgo2, eines der beiden humanen Shugoshin-Homologe, in der Prophase erst an Kinetochore rekrutiert wird, danach während Prometaphase an Zentromere bindet, um schließlich in Metaphase wieder an die Kinetochore zurückzukehren. Des Weiteren wurde nachgewiesen, dass (1) die Chromatin-Bindung von hSgo2 durch seinen C-Terminus vermittelt wird, dass (2) die katalytische Aktivität der Kinase Aurora B benötigt wird, um hSgo2 am Zentromer anzureichern und dass (3) die Bindung von Mikrotubuli an Kinetochore ausreichend ist für die Relokalisierung von hSgo2 in Metaphase; durch Mikrotubuli ausgeübte Zugkräfte sind hierfür nicht zwingend notwendig. Durch diese neu identifizierten Regulationsmechanismen ist es möglich, ein Modell für die subzelluläre Lokalisierung von Shugoshin aufzustellen. Gegenwärtig gibt es in der Literatur widersprüchliche Angaben darüber, ob und in wiefern hSgo1 und hSgo2 in der Mitose benötigt werden. Detaillierte zellbiologische Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit zeigen, dass hSgo2 entgegen früherer Annahmen an mehreren Prozessen während der Mitose nicht beteiligt ist. Insofern kann darauf geschlossen werden, dass die Funktionsbereiche der Shugoshin-Homologe weitestgehend getrennt sind: Sgo1 fungiert in Mitose während Sgo2 in der Meiose benötigt wird. Zu Beginn dieser Arbeit war es noch nicht klar, wie Shugoshin-Proteine auf molekularer Ebene positiv auf die Schwesterchromatid-Kohäsion wirken können. Es konnte hier mittels eines biochemischen Ansatzes die Proteinphosphatase 2A (PP2A) als neuer Interaktionspartner von hSgo1 identifiziert werden. Obwohl in der Zwischenzeit bekannt wurde, dass Shugoshin-gebundene PP2A Kohäsin durch direkte Dephosphorylierung schützt, konnte hier erstmals gezeigt werden, dass hSgo2 mittels seines N-Terminus an PP2A bindet. Außerdem bewirkt hSgo2-Bindung eine deutliche Stimulierung der katalytischen Aktivität von PP2A. Deshalb ist die Schlussfolgerung möglich, dass die Funktion von Shugoshin über eine bloße Verbindung zwischen Kohäsin und PP2A hinausgeht. Der Spindelaufbau-Kontrollpunkt (SAC) verzögert als essentieller Regulator von Mitose und Meiose den Beginn der Anaphase so lange, bis alle Chromosomen korrekt an der mitotischen Spindel angebracht sind. Der Signaltransduktionsweg des SAC beinhaltet einen Kinetochor-gebundenen Mad1-Mad2-Komplex, der eine Komformationsänderung von löslichem Mad2 katalysiert, das hierdurch die Fähigkeit erlangt, das Cdc20-Protein durch Bindung zu inhibieren. Die durch den SAC bewirkte Verhinderung von Anaphase überlappt mit dem Zeitraum, in dem Shugoshin benötigt wird. In dieser Arbeit konnte Mad2 als ein weiterer neuer Interaktor von hSgo2 gefunden werden. Die exakte Kartierung der Mad2-Bindestelle führte zur Entdeckung eines konservierten Mad2-Interaktionsmotivs (MIM) im N-terminalen Bereich von hSgo2, wie es auch in den schon bekannten Mad2-Bindepartnern Mad1 und Cdc20 vorkommt. Durch eine eingehende Charakterisierung des Sgo2-Mad2-Komplexes konnte gezeigt werden, dass dieser in seiner Struktur den Mad1-Mad2- und Cdc20-Mad2-Komplexen sehr ähnlich ist. Die hier durchgeführten biochemischen Analysen stellen die bisherige Überzeugung in Frage, nach der der SAC lediglich einen Signalgeber (Mad1 am Kinetochor) und ein Zielobjekt (Cdc20) hat. Die Mad2-Bindung ist für das einzige Shugoshin-Homolog in Xenopus laevis, xSgo1, konserviert. Dies legt eine wichtige Funktion dieser Interaktion in der Meiose nahe.