Charakterisierung des Replikationsenzyms ORF904 aus Sulfolobus islandicus

Titelangaben

Sanchez, Martin:
Charakterisierung des Replikationsenzyms ORF904 aus Sulfolobus islandicus.
Bayreuth , 2010
( Dissertation, 2010 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

ORF904 ist ein multifunktionelles Enzym, welches durch das kryptische Plasmid pRN1 codiert wird. Das Protein besitzt eine C-terminale Primase/Polymerasedomäne und eine N-terminale ATPase/Helikasedomäne. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die molekulare Funktion der N-terminalen Domäne genauer untersucht. Sequenzanalysen der Helikasedomäne ermöglichten ORF904 als eine Superfamilie-3-Helikase zu klassifizieren und für die ATPase- und Translokationsaktivität relevante Sequenzmotive zu identifizieren. Darüber hinaus konnte zusätzlich eine Winged-Helix-DNA-Bindedomäne am C-Terminus der Helikasedomäne identifiziert werden. An Hand von CD-Messungen konnte gezeigt werden, dass die Deletionsmutanten von ORF904 strukturiert vorlagen. Die thermische Denaturierung der Mutanten unterstreicht den thermophilen Charakter des Proteins (TM= 85-100°C). Der endgültige Nachweis der Hexamerisierung des Proteins in Gegenwart von dsDNA und AMP-PnP wurde mit der Cryo-Transmissionselektronenmikroskopie erbracht. Es war bereits bekannt, dass die ATPase-Aktivität von ORF904 durch RNA gar nicht und durch ssDNA nur schwach stimuliert wird. Eine spezifische Zunahme der ATPase-Aktivität in Gegenwart von pRN1 konnte nicht beobachtet werden. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass dsDNA die ATPase-Aktivität um den Faktor 7 erhöht. Eine Bevorzugung der längeren Plasmid-DNA unter limitierenden Bedingungen konnte nicht beobachtet werden, weswegen von einer geringen Prozessivität der Helikase auszugehen ist. Die Wechselzahl und der KM für ATP konnten zu 0,7/s und 0,4 mM bestimmt werden. Die ATPase-Aktivität der Deletionsmutanten von ORF904 gaben Hinweise auf die Wichtigkeit der Region direkt N-terminal vor dem Helikasekernbereich. Es wird angenommen, dass diese Region für die Hexamerisierung des Proteins von Bedeutung ist. Die Analyse der Punktmutanten von ORF904 in den konservierten Bereichen erlaubten es R690 als den Argininfinger zu identifiziert. Der potentielle Lysinfinger K574 konnte nicht als solcher identifiziert werden. Wie zu erwarten war, zeigten die Mutanten des beta-Hairpins eine vernachlässigbare Abnahme in Gegenwart von dsDNA. Translokationsexperimente mit einem Biotin-Streptavidin-Verdrängungsversuch ermöglichten es, für die Helikase eine durch ATP induzierbare Translokation mit 3-5-Polarität auf ssDNA nachzuweisen. Dabei konnte K657 als das Lysin im beta-Hairpin identifiziert werden, welches vermutlich den direkten Kontakt zur DNA herstellt. Die Translokationsrate von ORF904 wurde zu etwa 6,2x10^-4 b/s bestimmt. Zusammen mit den Ergebnissen der Prozessivität ist anzunehmen, dass es sich bei OF904 nicht um eine prozessive Helikase handelt. Vielmehr scheint ORF904 am Aufschmelzen des Replikationsursprungs beteiligt zu sein. In der Vergangenheit konnte keine Entwindung von komplett doppelsträngigen Helikasesubstraten oder Substraten mit 5- oder 3-Überhang auf der Basis von M13-DNA oder Oligodesoxynukleotiden gezeigt werden. Es konnte jedoch eine ATP-abhängige Entwindung für ein kurzes DNA-Substrat mit 3- und 5-Überhang, ein Doppelstrangsubstrat mit internem 5-Überhang, eine Holliday-Struktur sowie eine Triple-Helix gezeigt werden. Mittels der letzten drei Substrate wurde auch die Translokation auf dsDNA nachgewiesen. Die Entwindungsraten für die Helikase liegen abhängig vom Substrat zwischen 1,0 und 7,2x10^-4 bp/s. Die Ergebnisse der Entwindungsexperimente untermauern nochmals die Ergebnisse der Translokationsexperimente. DNA-Bindungsexperimente auf der Basis von Fluoreszenzanisotropiemessungen bestätigten die DNA-Bindung der carboxyterminalen DNA-Bindedomäne und der Helikasedomäne, die in Gegenwart von ATP zunahm. Darüber hinaus scheint es, dass die Prim/Pol-Domäne in der Lage ist, die Helikasedomäne in Gegenwart von ATP und Abwesenheit des GTG-Bindemotivs zu maskieren, um so unter Umständen eine unspezifische DNA-Bindung zu erschweren. In Gegenwart des GTG-Bindemotivs bindet die Prim/Pol-Domäne ssDNA sowie dsDNA stärker. Dieser Effekt wird für ssDNA durch ATP weiter verstärkt. Möglicherweise unterstützt die Prim/Pol-Domäne die DNA-Bindung der Helikase bei Vorliegen des GTG-Bindemotivs im Bereich des Replikationsursprungs. Um den Replikationsursprung zu bestimmen, wurden mit einem für die Replikation essentiellen Sequenzabschnitt stromabwärts von orf904 Footprint-Analysen durchgeführt. Diese erlaubten es, Nukleotide in einer Region 60 bis 90 Nukleotide stromabwärts von orf904 zu identifizieren, die durch die Winged-Helix-DNA-Bindedomäne scheinbar geschützt werden. Interessanterweise befindet sich in diesem Bereich auch ein GTG-Motiv, das als Erkennungssequenz für die Prim/Pol-Domäne dienen könnte, um die Bindung des Proteins an den vermeintlichen Replikationsursprung zu verstärken. Im Ganzen deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die Winged-Helix-DNA-Bindedomäne zusammen mit der Helikasedomäne den Replikationsursprung während der Replikationsinitiation erkennt.

Abstract in weiterer Sprache

ORF904 is a multifunctional protein encoded by the cryptic plasmid pRN1. The protein has a C-terminal primase/polymerase domain and an N-terminal ATPase/helicase domain. It was aim of this work to address the molecular function of the ATPase/helicase domain in replication. Sequence analysis of the helicase domain allowed to classify ORF904 as a superfamily 3 helicase and to identify critical residues for the ATPase and translocation activity. Furthermore, an additional winged helix DNA binding domain at the C-terminus of the helicase domain could be delineated. On the basis of CD-measurements it could be shown that all deletion mutants of ORF904 were folded. The thermal denaturation of the mutants underscores the proteins thermophilic character (TM= 85-100°C). The final proof for hexamerisation of the protein in the presence of dsDNA and AMP-PnP came from cryo-transmission electron microscopy experiments. It was already known that the ATPase activity of ORF904 is not stimulated by RNA and only weakly by ssDNA. No specific increase of the ATPase activity in the presence of pRN1 could be observed. But it could be shown that dsDNA increased ATPase activity 7-fold in comparison to ssDNA. No preference for the longer plasmid DNA under limiting conditions could be observed, suggesting that the processivity of the helicase is probably very low. In kinetic experiments the turnover number and the KM for ATP were determined to be 0.7/s and 0.4 mM, respectively. The ATPase activity of the deletion mutants of ORF904 gave hints about the importance of the region located directly N-terminal to the core of the helicase domain. It is believed that this region is relevant for the hexamerisation of the protein. The analysis of the point mutants of ORF904 in the conserved regions revealed R690 to be the arginine finger. The potential lysine finger K574 could not be identified as such. As expected the mutants of the beta-hairpin showed a negligible decrease in ATPase activity in the presence of dsDNA. Translocation experiments with a streptavidin displacement assay allowed proving an ATP-inducible translocation activity with 3-5 polarity on ssDNA for the helicase. In addition, the translocation experiments allowed the identification of K657 as the lysine in the beta-hairpin which might directly interact with DNA. In kinetic experiments the translocation activity of ORF904 was determined to be 6.2x10^-4 b/s. The low value of the translocation rate together with the results from the processivity experiments suggest that ORF904 is not a processive helicase situated at the replication fork. Rather ORF904 might be involved in unwinding the replication origin. In the past no unwinding could be shown for completely double-stranded helicase substrates or substrates on the basis of M13 DNA or oligodeoxynucleotides with either a 3- or 5-overhang. However the helicase is able to unwind a short DNA substrate with 3- and 5-overhang, a double-strand substrate with internal 5-overhang, a substrate which resembles a Holliday junction as well as a DNA-triple-helix in an ATP-dependent manner. The latter three substrates were used to demonstrate the translocation on dsDNA as well. The unwinding rates of the helicase range from 1.0 to 7.2x10^-4 bp/s, depending on the substrate. The results reinforce the translocation results. DNA binding experiments based on fluorescence anisotropy measurements confirmed the DNA binding activity of the carboxy-terminal winged helix DNA binding domain and of the helicase, which increased in the presence of ATP. Furthermore, it seems that the prim/pol domain is capable of masking the helicase domain in the presence of ATP and the absence of the GTG binding motif, probably to impede unspecific binding. In the presence of the GTG binding motif the prim/pol domain binds ssDNA as well as dsDNA more strongly. For ssDNA this effect is increased in the presence of ATP. Probably the prim/pol domain facilitates the DNA binding of the helicase domain when a GTG binding motif is located close to the origin of replication. In order to identify the origin of replication, footprint analysis were carried out with a section of DNA located downstream of orf904 which appears to be essential for replication. The footprints allowed the identification of nucleotides in a region 60 to 90 nucleotides downstream of orf904, which appeared to be protected by the winged helix DNA binding domain. Interestingly, a GTG motif which could be used by the prim/pol domain as a recognition sequence and that enhances the binding of the protein to the putative origin of replication was also found in this region. In aggregate the data suggests that the winged-helix DNA binding domain recognizes together with the helicase domain the replication origin during replication initiation.