Auswirkungen der RNA-Interferenz auf allatoregulierende Neuropeptide und Lokalisation der B-Typ Allatostatine bei Spodoptera frugiperda

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Griebler, Manuela:
Auswirkungen der RNA-Interferenz auf allatoregulierende Neuropeptide und Lokalisation der B-Typ Allatostatine bei Spodoptera frugiperda.
Bayreuth , 2009
( Dissertation, 2009 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Zusammenfassung Bei Insekten regulieren Peptidhormone (Neuropeptide) viele physiologische und entwicklungsrelevante Prozesse, wie Wachstum, Häutung, Metamorphose, Reproduktion, Diapause, Fressverhalten und den Metabolismus. Allatoregulierende Neuropeptide hemmen (Allatostatine, AS) oder fördern (Allatotropine, AT) die Juvenilhormonbiosynthese in den Corpora allata, können aber auch andere Funktionen aufweisen, wie z.B. eine myoregulatorische Aktivität. In dieser Arbeit wurde zunächst die Lokalisation der B-Typ Allatostatine [W(X)6W-amide] aus Spodoptera frugiperda immunologisch untersucht. In Gehirnen adulter, 2 Tage alter Weibchen trat eine deutliche Immunfärbung in medianen neurosekretorischen Zellen des Protocerebrums, im oberen Bereich des Zentralkörpers und in den Antennalloben (Glomeruli) auf. In den Thorakal- und Abdominalganglien von Larven des letzten Larvenstadiums wurde eine intensive Färbung im Bereich des Neuropils und eine schwächere Immunreaktion im Bereich der lateral gelegenen neurosekretorischen Zellen beobachtet. Starke Färbung war auch in den Malpighischen Gefäßen sichtbar, die wahrscheinlich der apikalen Membran zwischen den Hauptzellen zuzuordnen ist, sowie im Mitteldarm und in larvalen Hoden. Anschließend wurden die physiologischen Funktionen der bereits charakterisierten allatoregulierenden Neuropeptide AT 2 und AS-C-Typ aus S. frugiperda nach einer Hemmung der Genexpression mittels der RNA-Interferenz Methode untersucht. Es wurden Expressionsstudien durchgeführt, um die Wirksamkeit und die Spezifität der RNA-Interferenz in verschiedenen Geweben zu überprüfen. Zudem wurden die Auswirkungen der RNA-Interferenz auf verschiedene physiologische Parameter untersucht. Dabei lag der Schwerpunkt der Experimente auf der Regulierung der Juvenilhormonbiosynthese, der Reproduktion, der Verpaarung und der Metamorphose. Nach Injektion und auch nach Fütterung von AS-C- bzw. AT 2-doppelsträngiger RNA (dsRNA) war die Expression der mRNA im Gehirn und Darm von Larven reduziert. Zudem führte die Injektion von AS-C- bzw. AT 2-dsRNA auch bei adulten Weibchen und Männchen unterschiedlicher Altersstufen zu einer Reduktion der Expression im Gehirn. Die Reduktion der Transkription bei Larven ging mit einem erhöhten Juvenilhormon(JH)-Titer in der Hämolymphe der Tiere einher. Dies lässt eine allatostate Aktivität der beiden Peptide zu diesem Zeitpunkt vermuten. Die Folge des erhöhten JH-Titers war eine Verlängerung des letzten Larvenstadiums. Bei adulten Weibchen war der Effekt der Injektion von AS-C- bzw. AT 2-dsRNA auf den JH-Titer vom Alter der Tiere abhängig und variierte innerhalb der JH-Homologen (JH I bis JH III). Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass beide Peptide bei adulten Weibchen unterschiedliche Wirkungen auf unterschiedliche JH-Homologe in spezifischen Stadien der Entwicklung haben. Adulte Männchen hatten nach einer Injektion von AS-C- bzw. AT 2-dsRNA an bestimmten Tagen einen erhöhten JH-Titer. Bei der Verpaarung werden mit der Spermatophore verschiedene Substanzen, darunter auch JH, vom Männchen auf das Weibchen übertragen. Bei mit Ringer injizierten Männchen konnte vor der Verpaarung JH in den akzessorischen Drüsen (AD) detektiert werden. Nach der Verpaarung nahm der JH-Titer in den männlichen AD stark ab. Bei unverpaarten Weibchen war kein JH in der Bursa copulatrix nachweisbar. Wurden die Weibchen jedoch verpaart, konnten große Mengen JH in der Bursa copulatrix gefunden werden. Mit AS-C-dsRNA injizierte Männchen zeigten vor der Verpaarung einen erhöhten JH-Titer in ihren AD, der nach der Verpaarung wieder niedriger war. Die mit diesen Männchen verpaarten Weibchen hatten einen erhöhten JH-Titer in der Bursa copulatrix im Vergleich zu mit Ringer injizierten verpaarten Weibchen. Die Ergebnisse lassen auf eine allatostate Wirkung der AS-C-Peptide auf den JH-Titer in den AD schließen. Bei mit AT 2-dsRNA injizierten Männchen war der JH-Titer in den AD, im Vergleich zu den Kontrollen, sowohl vor als auch nach der Verpaarung erniedrigt, ebenso wie in der Bursa copulatrix der mit diesen Männchen verpaarten Weibchen. Weibchen, die mit AS-C- bzw. AT 2-dsRNA injiziert worden waren, zeigten eine reduzierte Eiablage (Oviposition), ebenso wie Ringer injizierte Weibchen, die mit AS-C- bzw. AT 2-dsRNA injizierten Männchen verpaart worden waren. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass die Fertilität der Männchen und Weibchen durch Neuropeptide unterschiedlich beeinflusst wird, und damit auch die Eiproduktion und Eiablage der Weibchen. Insektenneuropeptide eignen sich als (Bio)Insektizide, da sie die Physiologie und das Verhalten der Insekten während der Entwicklung und Reproduktion beeinflussen bzw. regulieren. Eine Expression von spezifischen dsRNAs in transgenen Pflanzen, gerichtet gegen allatoregulierende Neuropeptidgene, könnte die gezielte Bekämpfung von Schadinsekten, wie z. B. des Agrarschädlings S. frugiperda, ermöglichen.

Abstract in weiterer Sprache

Summary Insect neuropeptides regulate most of the key functions in insects such as development, molting, metamorphosis, reproduction, diapause, feeding and energy metabolism. Allatoregulating neuropeptides are known to inhibit (allatostatins, AS) or activate (allatotropins, AT) the juvenile hormone (JH) biosynthesis in the corpora allata, but they occupy several other functions such as myoregulatory activity, too. At first, the localisation of B-type allatostatins [W(X)6W-amide] in Spodoptera frugiperda was investigated by immunostaining. Immunoreactive material was detected in the brain of 2-day old adult females especially in the median neurosecretory cells of the protocerebrum, in the central body and in the antennal lobes (glomeruli). Additionally, strong immunostaining was detected in the neuropil. At lower extent, immunoreactivity was found in lateral neurosecretory cells of the thoracic and abdominal ganglia of last instar larvae. Immunoreactive material was also localised in the Malpighian tubules, probably restricted to the apical membrane with concrements located between the cells, in the midgut and in the maturation zone of the testes. Immunostaing experiments were carried out to better find the expression sites for the respective preprohormone. However, various experiments to identify the gen sequence of B-type AS were unsuccessful. Next, the physiological functions of the known allatoregulating neuropeptides allatotropin AT 2 and allatostatin AS-C-type from S. frugiperda were studied after gene silencing using the RNA interference method. Expression studies were performed to proof the potency and specificity of the RNA interference in different tissues. Additionally, the effect of the RNA interference on various physiological parameters was determined. Experiments were focused on the regulation of juvenile hormone biosynthesis, reproduction, mating and metamorphosis. After injection or feeding of either the AS-C-type or the AT 2 dsRNA the transcript levels were reduced in the brain and gut of last instar larvae. Moreover, injection of AS-C-type or AT 2 dsRNA led to an age-specific suppression of expression in the brains of adult females and males. Suppression of the transcript level in larvae went ahead with an increased JH titer in the haemoylmph of the animals, suggesting an allatostatic activity of both peptides at this stage. As a result, the last larval stage was prolonged. In adult females the effect of AS-C or AT 2 dsRNA injections on the JH titer depended on the age of the moths and varied among the JH homologs (JH I to JH III), indicating that the peptides in adult females act either allatostatic or allatotropic on different JH homologs at specific developmental stages. In adult males the JH titer increased at distinct days after injection of AS-C or AT 2 dsRNA, respectively. In addition to the sperm, the males transfer various other substances, including JH, during copulation into the females. In unmated males, injected with Ringer solution, JH was detectable in the accessory sex glands (ASG). After mating, the JH titer strongly decreased in the ASG of males. In the bursa copulatrix of unmated females no JH was detectable, whereas in mated moths, a lot of JH was detectable. AS-C dsRNA injected males showed a high JH titer in the ASG before mating, which decreased after mating. Females mated with such males revealed an increased JH titer in the bursa copulatrix compared to females mated with Ringer controls. The results suggest an allatostatic activity of the AS-C peptides on the JH titer in the ASG. AT 2 dsRNA injected males showed a reduced JH titer in the ASG before and after mating, compared to the controls, and the same was true for the bursa copulatrix of females mated with such males. Oviposition rates were reduced in females, which had been injected with AS-C or AT 2 dsRNA, but also in Ringer injected females which had been mated with AS-C or AT 2 injected males. This suggests, that fertility of males and females is influenced by neuropeptides, and as a consequence egg production and oviposition of females are affected. Insect neuropeptides are qualified for insect control agents, since they regulate physiology and behaviour of insects during development and reproduction. Expression of specific dsRNA directed against suitable genes of allatoregulating neuropeptides in transgenic plants could give protection against pests, like S. frugiperda.