Die mitochondriale Biogenese in Saccharomyces cerevisiae: Identifizierung und Charakterisierung neuer Komponenten der mitochondrialen Funktion und Morphogenese

Titelangaben

Merz-Jakob, Sandra:
Die mitochondriale Biogenese in Saccharomyces cerevisiae: Identifizierung und Charakterisierung neuer Komponenten der mitochondrialen Funktion und Morphogenese.
Bayreuth , 2009
( Dissertation, 2009 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Deletionsbibliotheken sind heutzutage ein wertvolles Werkzeug, um Genfunktionen zu entschlüsseln und das Verständnis zellulärer Abläufe zu komplettieren. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden ausgehend von der ~4800 Deletionsmutanten nicht-essentieller Hefegene umfassenden MATalpha-Deletionsbibliothek large-scale Analysen durchgeführt, um das Verständnis zweier wichtiger Teilbereiche der mitochondrialen Biogenese zu erweitern, nämlich (1) dem Erhalt der Atmungsfähigkeit und (2) der mitochondriale Teilung als zentraler Bestandteil der Morphogenese. Die Biogenese der Atmungskette erfordert die koordinierte Expression des Kerngenoms und des mitochondrialen Genoms, wobei im Zellkern der Großteil der mitochondrialen Proteine kodiert wird und die mitochondriale DNA (mtDNA) nur wenige Gene enthält. Im ersten Teilabschnitt der vorliegenden Arbeit wurde ein systematischer, genomweiter Screen durchgeführt, um den Satz an kernkodierten Genen zu ermitteln, der für die respiratorische Aktivität sowie den Erhalt und die Expression der mtDNA in Hefe erforderlich ist. Durch vergleichende Gendeletionsanalysen konnte eine unerwartet große phänotypische Plastizität festgestellt werden. Darüber hinaus wurden zehn bisher uncharakterisierte Gene identifiziert, die essentiell für den Erhalt des respiratorischen Wachstums sind (RRG1 bis RRG10). Systematische funktionelle Analysen der 319 respiratorisch inkompetenten Mutanten enthüllten 16 Gene, die essentiell für den Erhalt mitochondrialer DNA sind, 88 Gene, die für die allgemeine mitochondriale Proteintranslation benötigt werden, und zehn Gene, die für die Expression bestimmter mitochondrialer Genprodukte erforderlich sind. In einer Gruppe von 23 Mutanten spielen vermutlich auch extragenomische Faktoren eine Rolle für mitochondriale Funktionen. Darunter waren vier Deletionsstämme mit fehlerhafter Assemblierung der Cytochrom c Oxidase. Diese akkumulieren verstärkt reaktive Sauerstoffspezies (ROS), was zu einer schnelleren Alterung führt. Insgesamt verbessern die gewonnenen Daten das Verständnis der molekularen Prozesse, die zum Erhalt der mtDNA, zur mitochondrialen Proteintranslation und zur Assemblierung der Atmungskette beitragen. Sie deckten mehrere bisher uncharakterisierte Komponenten auf und liefern ein umfassendes Bild der molekularen Prozesse, die für die respiratorische Kompetenz in einer relativ einfachen eukaryotischen Zelle benötigt werden. Die zentrale Bedeutung der Mitochondrien in der Zelle beschränkt sich jedoch nicht nur auf die Atmungsfähigkeit. Mitochondrien sind vielmehr wichtige Bestandteile zahlreicher physiologischer Prozesse, deren Funktionalität maßgeblich von der mitochondrialen Dynamik, insbesondere der Fusion und Teilung, abhängt. Der zweite Teilabschnitt der Arbeit beschäftigte sich deshalb mit der mitochondrialen Teilung. Mdm33, ein integrales Innenmembranprotein der Hefemitochondrien, ist die bisher einzige bekannte Komponente der Innenmembranteilung. Seine Überexpression bedingt eine mitochondriale Fragmentierung, die mit einem starken Wachstumsdefekt einher geht. Mögliche Wechselwirkungspartner waren nicht bekannt. Deshalb wurde ein genetischer Screen durchgeführt, um direkte oder indirekte Wechselwirkungspartner von Mdm33 zu identifizieren. MDM33 wurde in einer Auswahl von 164 Hefedeletionsmutanten überexprimiert, in denen vor allem mitochondrial lokalisierte Proteine fehlten. Anhand der Kriterien Wachstumsfähigkeit und blockierte mitochondriale Fragmentierung bei Überexpression von MDM33 wurden sieben bisher uncharakterisierte genetische Interaktions-partner identifiziert, die möglicherweise mit Mdm33 funktionell wechselwirken. Dnm1 und Mdv1 sind Komponenten der mitochondrialen Außenmembranteilungsmaschinerie. Die Detektion der Deletionsstämme deltadnm1 und deltamdv1 im Screen als MDM33-überexpressions-tolerant weist auf eine Funktion der Außenmembranteilungsmaschinerie bei der Entstehung des MDM33-Überexpressionsphänotyps hin und zeigt gleichzeitig, dass die Funktion von Mdm33 upstream der Außenmembranteilungsmaschinerie liegt. Dnm1 kann auch in Abwesenheit von Mdm33 auf der mitochondrialen Oberfläche assemblieren. Die Mdm33-abhängige Modulation der Teilungsaktivität erfolgt also nicht durch eine verhinderte Assemblierung, sondern wahrscheinlich durch eine veränderte Aktivierung der Außenmembranteilungsmaschinerie. Diese Ergebnisse liefern weitere Einblicke in den Zusammenhang zwischen der Mdm33-Funktion und der Außenmembranteilungsmaschinerie und untermauern damit die Gültigkeit des bestehenden Mdm33-Wirkmodells, in dem Mdm33 als Voraussetzung für die Außenmembranteilung die Innenmembranteilung/Einschnürung des Mitochondrientubulus vermittelt. Damit wurde ein weiterer Schritt zur Komplettierung des Bilds der mitochondrialen Teilungsmaschinerie getan.

Abstract in weiterer Sprache

Today deletion libraries are very valuable tools to decipher gene functions and to increase the knowledge about cellular processes. Based on the MATalpha-yeast deletion library, which covers ~4800 deletion mutants of non-essential genes, the present work was aimed at large-scale analyses to further the understanding of two important processes of mitochondrial biogenesis: (1) maintenance of respiratory competence and (2) mitochondrial fission as a part of morphogenesis. Biogenesis of the respiratory chain requires the coordinated expression of the nuclear and the mitochondrial genomes, while the nucleus encodes the vast majority and the mtDNA only a few of the mitochondrial proteins. In the first part of this work, a systematic genome-wide screen was conducted to identify the complete set of nuclear-encoded genes that are essential for respiratory activity, mitochondrial gene expression and mitochondrial genome maintenance. Comparative gene deletion analysis revealed an astonishing phenotypic plasticity. Furthermore ten hitherto uncharacterized genes (RRG1 to RRG10) were found to be essential for maintenance of respiratory competence. Systematic functional analysis of all of the identified 319 respiratory-deficient mutants disclosed 16 genes essential for maintenance of mtDNA, 88 genes important for mitochondrial protein synthesis, and ten genes required for expression of specific mitochondrial gene products. In a group of 23 mutants, extra-genomic factors are presumably important for maintenance of respiratory activity. Among these were four deletion mutants with impaired assembly of cytochrome c oxidase, which accumulated reactive oxygen species (ROS) rendering the mutants more sensitive to ageing. Taken together, these data contribute to the understanding of the molecular processes involved in mtDNA maintenance, mitochondrial protein synthesis and assembly of the respiratory chain. They revealed a number of so far uncharacterized components and provide a comprehensive picture of the molecular processes required for respiratory competence in a relatively simple eukaryotic cell. The central role of mitochondria within the cell is not exclusively related to respiratory competence. In fact, mitochondria are major players of many physiological processes and their functionality depends on the mitochondrias highly dynamic nature, in particular on fusion and fission. Thus, the second part of the present work focused on mitochondrial fission. Mdm33, an integral inner membrane protein of yeast mitochondria, is the only known player of mitochondrial inner membrane fission. Its overexpression leads to mitochondrial fragmentation, accompanied by a severe growth defect. Possible interaction partners of Mdm33 are currently unknown. Therefore a genetic screen was conducted to identify direct or indirect interaction partners of Mdm33. MDM33 was overexpressed in a deletion mutant collection covering 164 non-essential genes of Saccharomyces cerevisiae encoding mitochondria-localized proteins. Seven so far uncharacterised genetic interaction partners were identified which possibly functionally interact with Mdm33 as deletion of the respective genes restored growth and blocked mitochondrial fragmentation in the presence of excess Mdm33. Dnm1 and Mdv1 are components of the mitochondrial outer membrane fission machinery. Detection of the deletion strains deltadnm1 and deltamdv1 as MDM33 overexpression-tolerant demonstrates the contribution of the outer membrane fission machinery to the development of the MDM33 overexpressionphenotype. At the same time, it shows that Mdm33 influences fission activity upstream the outer membrane fission machinery. In the absence of Mdm33 Dnm1 is still able to assemble on the mitochondrial surface. Thus, the Mdm33-dependent modulation of fission activity does not result from inhibited assembly, but rather from an altered activation of the outer membrane fission machinery. These results provide further insights into the connection between Mdm33 function and the outer membrane fission machinery. They confirm the current hypothesis on Mdm33 function, which proposes Mdm33 to mediate fission of the inner membrane and/or constriction of the mitochondrial tubule as a prerequisite of outer membrane fission. Taken together, these data contribute to an understanding of mitochondrial fission machinery.