Denitrification, Dissimilatory Nitrate Reduction, and Methanogenesis in the Gut of Earthworms (Oligochaeta): Assessment of Greenhouse Gases and Genetic Markers

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Depkat-Jakob, Peter:
Denitrification, Dissimilatory Nitrate Reduction, and Methanogenesis in the Gut of Earthworms (Oligochaeta): Assessment of Greenhouse Gases and Genetic Markers.
Bayreuth , 2013
( Dissertation, 2013 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

The earthworm gut is an anoxic microzone in aerated soils, shows a high water content and high amounts of nitrite and organic carbon. These conditions are in marked contrast to those in the pre-ingested material (i.e., substrate) and ideal for microorganisms as those capable of fermentations, for denitrifiers, and dissimilatory nitrate reducers (DNR). Thus, substrate-derived denitrifiers in the earthworm gut (Lumbricidae) emit the greenhouse gas N2O as well as N2. One large species (Megascolecidae) emitted no N2O, leading to the hypothesis that large earthworms cannot emit nitrogenous gases, i.e., N2O and N2. There was no emission of the greenhouse gas CH4 reported for earthworm species. The current study analyzed ten earthworm species of different families, sizes, and feeding guilds (i.e., burrow and feeding habits) from Brazil for the emission of nitrogenous gases and CH4. Taxa affiliated with these emissions, i.e., denitrifiers, DNR, and methanogens were analyzed with cloning and pyrosequencing of marker genes, from gut contents and substrates of earthworm species from Brazil (Amynthas gracilis, Glossoscolex paulistus, Eudrilus eugeniae), Germany (Aporrectodea caliginosa, Lumbricus terrestris, Lumbricus rubellus), and New Zealand (Octochaetus multiporus) on gene and partly on transcript levels. Potential denitrifiers and methanogens were isolated and enriched from earthworm gut contents, respectively. Sequences of narG (encoding for a nitrate reductase; targets denitrifiers and DNR), nirK, nirS (both encoding for a nitrite reductase; target denitrifiers), nosZ (encoding for a N2O reductase; targets denitrifiers), and mcrA/mrtA (encoding for the methyl-CoM reductase and its isoenzyme; target methanogenic Archaea) were analyzed. For nirK and nirS, cutoff values were calculated to define species-level affiliations according to their sequence similarities. Perionyx excavatus, A. gracilis (both Megascolecidae), Pontoscolex corethrurus, Rhinodrilus alatus (both Glossoscolecidae), Dichogaster annae, Dichogaster sp. (both Acanthodrilidae), and E. eugeniae (Eudrilidae) emitted nitrogenous gases; G. paulistus, Glossoscolex sp. (both Glossoscolecidae), and Eisenia andrei (Lumbricidae) did not. Earthworm substrates emitted smaller amounts of nitrogenous gases, predominantly N2. When provided with nitrite, G. paulistus emitted nitrogenous gases but total emissions and the ratio of N2O to N2 were higher for A. gracilis. It was shown that earthworms of all families, sizes, and feeding guilds can emit nitrogenous gases, and that the earthworm substrate, size, and feeding guild were influencing but not determinative factors taken alone. In earthworms gut contents, denitrifiers were predominantly affiliated with Bradyrhizobiaceae (Rhizobiales), indicating that here, these taxa might be responsible for the emission of nitrogenous gases. Active DNR were predominantly affiliated with Mycobacterium (Actinomycetales), and it is anticipated that these Bacteria compete with denitrifiers for nitrate. Gene analyses and isolation approaches demonstrated that (i) both denitrifiers and DNR in the earthworm gut were derived from ingested material and (ii) diversity in the gut was influenced by the earthworm feeding guild. Analyses of genes and transcripts from earthworms from Germany demonstrated that there was a selective activation of substrate-derived denitrifiers and DNR in the gut. E. eugeniae emitted the highest amounts of CH4, P. corethrurus and R. alatus emitted less, all other tested species no CH4. One substrate emitted minor amounts of CH4, all others did not emit CH4. Certain substrates appeared to influence the emission of CH4 by earthworms but the substrate taken alone was not a determinative factor. The capacity to emit CH4 by E. eugeniae was not significantly affected by supplemental H2/CO2 and was at least partly retained when maintained on diverse alternative substrates. Analysis of mcrA/mrtA revealed that selectively activated hydrogenotrophic and acetoclastic methanogens of the Methanosarcinaceae and Methanobacteriacea were the source of the CH4 emitted by E. eugeniae. These methanogens were assumed to be substrate-derived although a symbiotic affiliation with the earthworm cannot be excluded. Certain earthworms emitted both CH4 and nitrogenous gases, suggesting that methanogenesis and denitrification can be concomitant processes in the earthworm gut. This study demonstrated that (i) earthworms from all families, sizes, and feeding guilds can emit N2O and N2, (ii) substrate-derived and selectively activated denitrifiers within the Rhizobiales are the main source of N2O and N2 whereas Actinomycetales are the main active DNR, (iii) the earthworm feeding guild affects the selective activation of ingested denitrifiers and DNR, (iv) certain earthworms emit CH4, and Methanosarcinaceae and Methanobacteriaceae appear to be the main source of this CH4, and (v) certain earthworms can concomitantly emit N2O, N2, and CH4.

Abstract in weiterer Sprache

Der Regenwurmdarm ist eine anoxische Mikrozone in belüfteten Böden, zeigt einen hohen Wassergehalt und großen Mengen an Nitrit und organischem Kohlenstoff. Diese Bedingungen sind konträr zu jenen im Regenwurmsubstrat und ideal für Mikroorganismen wie Gärer, Denitrifikanten und dissimilatorische Nitratreduzierer (DNR). Deshalb emittieren aus dem aufgenommenen Material (Substrat) stammende Denitrifikanten im Darm von Regenwürmern (Lumbricidae) das Treibhausgas N2O, und auch N2. Eine große Regenwurmart (Megascolecicdae) emittierte dagegen kein N2O. Dies führte zu der Hypothese, dass große Regenwurmarten kein N2O emittieren können. Keine getestete Regenwurmart emittierte das Treibhausgas CH4. Die vorliegende Studie untersuchte zehn Regenwurmarten unterschiedlicher Familien, Größen, und Lebens- und Ernährungsweisen (Ökotypen) aus Brasilien auf die Emission von Stickstoffgasen (d.h. N2O und N2; N-Gase) und CH4 hin. Taxa von Denitrifikanten, DNR und Methanogenen wurden mit Klonierung und Pyrosequenzierung von Markergenen in Darminhalt und Substraten von Regenwurmarten aus Brasilien (Amynthas gracilis, Glossoscolex paulistus, Eudrilus eugeniae), Deutschland (Aporrectodea caliginosa, Lumbricus terrestris, Lumbricus rubellus) und Neuseeland (Octochaetus multiporus) auf Gen- und teilweise Transkriptionsebene untersucht. Potenzielle Denitrifikanten und Methanogene wurden aus dem Regenwurmdarm isoliert bzw. angereichert. Sequenzen von narG (codiert für eine Nitratreduktase; erfasst Denitrifikanten und DNR), nirK und nirS (codieren für Nitritreduktasen; erfassten Denitrifikanten), nosZ (codiert für eine N2O-Reduktase; erfasst Denitrifikanten) und mcrA/mrtA (codieren für eine Methyl-CoM-Reduktase und deren Isoenzym; erfassen methanogene Archaeen) wurden analysiert. Für nirK und nirS wurden Grenzwerte errechnet, um Arten auf Basis von Gen- und Proteinsequenzunterschieden zu definieren. Perionyx excavatus, A. gracilis, (beide Megascolecidae), Pontoscolex corethrurus, Rhinodrilus alatus (beide Glossoscolecidae), Dichogaster annae, Dichogaster sp. (beide Acanthodrilidae) und E. eugeniae (Eudrilidae) emittierten N-Gase, G. paulistus, Glossoscolex sp. (beide Glossoscolecidae) und Eisenia andrei (Lumbricidae) nicht. Die Substrate emittierten geringe Mengen an N-Gasen, v.a. N2. Wenn Nitrit zugegeben wurde, emittierte G. paulistus N-Gase, die Gesamtmenge an N-Gasen und das Verhältnis von N2O zu N2 waren bei A. gracilis jedoch höher. Es wurde gezeigt, dass Regenwürmer jeder Familie, Größe und jedes Ökotyps N-Gase emittieren können. Hierbei waren Regenwurmsubstrat, -größe, und -ökotyp Hauptfaktoren, ein Faktor für sich allein jedoch nicht ausschlaggebend. Denitrifikanten im Regenwurmdarm waren hauptsächlich Bradyrhizobiaceae (Rhizobiales) zuordenbar, die dort für die Emission von N-Gasen verantwortlich zu sein schienen. Aktive DNR waren v.a. Mycobacterium (Actinomycetales) zuordenbar, die mit Denitrifikanten um Nitrat konkurrieren könnten. Genanalysen und Isolierungsansätze zeigten, dass Denitrifikaten und DNR im Regenwurmdarm aus dem Substrat stammten und deren Diversität vom Regenwurm-Ökotyp beeinflusst wurde. Gen- und Transkriptionsanalysen mit Regenwürmern aus Deutschland zeigten, dass im Darm eine selektive Aktivierung von über das Substrat aufgenommenen Denitrifikanten und DNR stattfand. E. eugeniae emittierte die größten Mengen an CH4, P. corethrurus und R. alatus weniger, alle anderen Arten kein CH4. Ein Substrat emittierte geringe Mengen an CH4, alle anderen gar keines. Einige Substrate schienen Einfluss auf die Emission von CH4 seitens des Regenwurms zu nehmen, waren jedoch nicht der alleinige Faktor. Die Emission von CH4 durch E. eugeniae wurde nur wenig von zugegebenem H2/CO2 beeinflusst und blieb auch nach einer Vorinkubation auf verschiedenen alternativen Substraten teilweise erhalten. Die Analyse von mcrA/mrtA zeigte, dass aktivierte hydrogenotrophe und acetoklastische Methanogene der Methanosarcinaceae und Methanobacteriaceae die Quelle des von E. eugeniae emittierten CH4 zu sein schienen. Diese Taxa schienen aus dem Substrat zu stammen, eine symbiotische Beziehung mit dem Regenwurm wäre jedoch auch denkbar. Einige Regenwürmer emittierten CH4 und N-Gase, was darauf schließen lässt, dass Methanogenese und Denitrifikation gleichzeitig im Regenwurmdarm ablaufen können. Die Daten der vorliegenden Studie zeigen, dass (i) Regenwürmer jeder Familie, Größe und jedes Ökotyps N2O und N2 emittieren können, dass (ii) aus dem Substrat stammende und selektiv aktivierte Denitrifikanten (Rhizobiales) die Hauptquelle der N-Gase zu sein scheinen während Actinomycetales die aktivsten DNR sind, dass (iii) der Regenwurm-Ökotyp diese selektive Aktivierung von Denitrifikanten und DNR beeinflusst, dass (iv) einige Regenwürmer CH4 emittieren können und Methanosarcinaceae und Methanobacteriaceae die Quelle des emittierten CH4 zu sein scheinen, und dass (v) bestimmte Regenwürmer N2O, N2 und CH4 gleichzeitig emittieren können.