Funktion und Einfluss der nicht-repetitiven, terminalen Domänen auf Speicherung und Assemblierung von Spinnenseidenproteinen

Titelangaben

Eisoldt, Lukas:
Funktion und Einfluss der nicht-repetitiven, terminalen Domänen auf Speicherung und Assemblierung von Spinnenseidenproteinen.
Bayreuth , 2013 . - 135 S.
( Dissertation, 2013 , Universität Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT)

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Abstract

Weibliche Radnetzspinnen sind in der Lage bis zu sechs verschiedene Spinnenseidenfasern mit unterschiedlichen mechanischen Eigenschaften herzustellen, die denen von syntheti-schen Hochleistungsfasern wie Kevlar oder Hochleistungsstahl zum Teil überlegen sind. Die am besten untersuchte Spinnenseide ist diejenige, die für die Speichen, den Rahmen sowie als Abseilfaden verwendet wird. Sie wird als dragline-Seide bezeichnet und ist hauptsächlich aus zwei Proteinklassen aufgebaut, die als MaSp1 und MaSp2(Major Ampullate Spidroin) bezeichnet werden. Die mehrere hundert Kilodalton großen Spidroine bestehen im Wesentlichen aus einer repetitiven, strukturell ungeordneten Kerndomäne, die von relativ kleinen, ca. 100-140 Aminosäuren langen nicht-repetitiven, globulären Domänen flankiert ist. Das Hauptunterscheidungsmerkmal zwischen MaSp1 und 2 ist der Prolingehalt der repetitiven Sequenzen wobei in MaSp2 viel (>10%) und MaSp1 (<0,4%) wenig Proline enthalten sind. In der dragline Seide der Gartenkreuzspinne Araneus diadematus sind zwei Spidroine, genannt ADF3 und 4, mit einem hohen Prolingehalt identifiziert wor-den, die beide deshalb zur Klasse der MaSp2-Proteine gehören. Die nicht-repetitiven terminalen Domänen sind globulär gefaltet und die Sequenzen sind über verschiedene Sei-denarten und Spezies stark konserviert. Ziel dieser Arbeit war es den Einfluss der nicht-repetitiven amino- (NTD) und carboxyterminalen (CTD) Domänen auf das Lösungs- und Assemblierungsverhalten von rekombinanten Spinnenseidenproteinen auf Basis von ADF3 und 4 zu untersuchen. Der Fokus lag dabei zunächst auf der carboxyterminalen Domäne NR3 des Spinnenseidenproteins ADF3 aus A. diadematus. Die Struktur der Domäne wurde in Zusammenarbeit mit Dr. Franz Hagn (AG Kessler – TU München) mit Hilfe von NMR gelöst. Es bildet in Lösung ein parallel orientiertes, mittels Disulfidbrücke kovalent verknüpftes Dimer aus, zu dessen Struktur bisher keine Homologen bekannt sind. Es konnte gezeigt werden, dass die NR3-Domäne in Lösung die Bildung von sphärischen mizellartigen Assemblaten vermittelt, wie sie auch im natürlichen Spinntrakt beobachtet wurden. Eine weitere wichtige Rolle konnte bei der scherkraftinduzierten Assemblierung beobachtet werden, wo nur eADF3-Proteine mit der NR3-Domäne in der Lage sind ausgerichtete Faserbündel auszubilden. In einem weiteren Projektteil wurde die Interaktion zwischen rekombinanten Varianten von ADF3 und 4 untersucht, da beide Proteine mit hoher Wahrscheinlichkeit auch in der Spinne in den gleichen Zellen produziert werden. Es konnte gezeigt werden, dass durch Co-Expression der entsprechenden Gene von eADF3-NR3 und eADF4-NR4 in E. coli ein NR3-NR4 vermitteltes Heterodimer entsteht. Dieses Heterodimer besitzt eine vergleichbare strukturelle Integrität wie die entsprechenden Homodimere. Das durch Phosphationen induzierte Assemblierungsverhalten des Heterodimers unterscheidet sich signifikant von dem der Homodimere. Während eADF3-NR3 sphärische Assemblate bildet und eADF4-NR4 mehrere hundert Nanometer lange Fibrillen, wie sie in ähnlicher Form in den natürlichen Fasern beobachtet wurden, lagert sich das Heterodimer zu einem Netzwerk aus im Vergleich dünneren und weniger langen Fibrillen zusammen. Diese Entdeckung ist unter Umständen wichtig für das Verständnis des natürlichen Spinnprozesses. Aus biotechnologischer Sicht stellt die quantitative Verknüpfung von Spinnenseidenproteinen mit unter-schiedlichen Eigenschaften über die carboxyterminalen Domänen einen interessanten Ansatz zur Generierung von neuen Materialien mit einstellbaren Eigenschaften dar. Letztendlich wurden rekombinante eADF3 Spinnenseidenproteine, die sowohl amino- als auch carboxyterminale Domänen aufwiesen, näher charakterisiert. Die isolierte aminoterminale Domäne bildet bei Senkung des pH-Wertes von 7 auf 6 ein antiparalleles Dimer aus. Es konnte gezeigt werden, dass NTD-eADF3-Proteine, die nur die aminoterminale Domäne N1 enthielten, ebenfalls pH-abhängig Dimere bilden. Bei eADF3-Proteinen mit beiden terminalen Domänen, die per se als CTD-vermitteltes kovalentes Dimer vorliegen, ist die Ausbildung eines aminoterminal vermittelten intermolekularen Dimers-vom-Dimer hingegen nur schwach ausgebildet. Weitere Experimente deuten jedoch darauf hin, dass die NTD in einem intramolekularen Dimer vorliegen. Die Ergebnisse zeigen, dass die CTD einen starken Einfluss auf die Ausrichtung der repetitiven Kerndomäne hat und somit auch die NTD vermittelte intermolekulare Dimerisierung beeinflussen kann. Die Erkenntnisse wurden verwendet um ein Modell über die molekularen Abläufe während des Spinnprozesses zu erstellen, dass sowohl die Speicherung der Proteine als auch die Assemblierung mit einschließt.

Abstract in weiterer Sprache

Female orb weaving spiders are able to produce up to six different silk types each with different mechanical properties rivaling many man-made high performance fibers like Kevlar or steel. The best investigated silk type is the so-called dragline silk which is used for the frame and radii of an orb web, as well as for a life line. Dragline silk comprises two protein classes named MaSp1 and 2 (Major Ampullate Spidroin). Spidroins are usually several hundred kilodalton in size and consist of a large repetitive core domain being flanked by 100-140 amino acid long non-repetitive domains. The main difference between both MaSp protein classes is their proline content with MaSp2 showing a high abundance (>10%) and MaSp1 a low one (<0.4%). The dragline silk of the European garden spider Araneus diadematus show two MaSp2 proteins, named ADF3 and 4 (A. diadematus Fibroin). The small and globular non repetitive terminal domains show high sequence conservation between different silk types and species. The aim of this work was to investigate the role of the non-repetitive aminoterminal (NTD) and carboxyterminal (CTD) domains during storage and assembly of recombinant spider silk proteins based on ADF3 and 4. First experiments focused on the non-repetitive carboxyterminal domain NR3 from ADF3. The structure of this protein was solved using NMR techniques in cooperation with Dr. Franz Hagn (AG Kessler, TU München). NR3 forms a parallel dimer, covalently linked by a disulfide bond and with no known structural homologues. It could be shown that NR3 influences eADF3 proteins (engineered ADF3) in solution as well as during assembly. In solution it mediates the formation of spherical, micelle-like assemblies which were also observed in the natural spinning gland during storage of the proteins. It was also shown that upon exposure to shear forces also occurring during the natural spinning process, eADF3 proteins bearing the NR3 domain are able to form well aligned fiber bundles. Another part of this work dealt with interactions between recombinant variants of ADF3 and 4, since both proteins are probably produced within the same cells inside the spider’s spinning gland. The work focused primarily on the highly homologous CTDs NR3 and NR4. It could be shown that upon coexpression of eADF3-NR3 and eADF4-NR4 genes in E. coli an NR3-NR4 mediated heterodimer was formed. The structural integrity of the heterodimer was comparable to that of the respective homodimers. When assembly was induced upon addition of phosphate ions, the morphologies of the heterodimer differed significantly from that of the two homodimers. While eADF3-NR3 formed spherical as-semblates, eADF4-NR4 formed fibrils with several hundred nanometers in length, whereas the heterodimer formed a small-meshed network consisting of in comparison shorter and thinner branched fibrils. The ability to combine silk proteins with different properties via the carboxyterminal domains constitutes a simple and convenient way to produce novel materials with tunable properties. Finally recombinant eADF3 proteins bearing both the amino- and carboxyterminal domain were characterized. Upon acidification from pH 7 to 6, which was also observed in the natural spinning duct, the isolated NTD forms an antiparallel dimer. It could be shown that NTD-eADF3 proteins also form dimers upon acidification. However, NTD-eADF-CTD proteins, which are present as covalently linked dimers via their CTDs, do not show the formation of pH-induced intermolecular tetramers. Further experiments confirmed that the NTD in those proteins rather formed intramolecular dimers showing a strong influence of the CTD on the orientation of the repetitive core domain. The findings were used to generate a model for the molecular mechanisms that occur dur-ing storage and assembly of the spider silk proteins in the natural spinning process.