Single-Particle Orbit Tracking - Setup, Characterisation and Application

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Ernst, Dominique:
Single-Particle Orbit Tracking - Setup, Characterisation and Application.
Bayreuth , 2013
( Dissertation, 2012 , Universität Bayreuth, Fakultät für Mathematik, Physik und Informatik)

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Abstract

In this thesis, the development and experimental realisation of an optical setup which records the 2-dimensional trajectories of single fluorescently labeled polystyrene beads, either 20nm or 50nm in diameter, with a high spatial and temporal resolution is introduced. Combining single molecule fluorescence techniques with a new method called single-particle orbit tracking the spatial position of the beads could be determined with an accuracy of less than 10nm at a time resolution of 4 ms. The idea is to manipulate the excitation light spatially and temporally to locate a particle. In order to do so, special optics which deflect a laser beam and guide it on a circular path were used. Subsequently, this rotating beam is projected by a microscope into the sample with the diffusing particles. Due to the spatially and periodically modulated excitation light, the emission signal of the bead is modulated with the frequency of the rotation of the laser focus. The amplitude of the modulated emission signal depends on the position of the particle within the excitation orbit. An ingeniously developed algorithm calculates the position of the particle with respect to the centre of the orbit by demodulating the emission signal and restores the particle back to the orbit centre. Applying this method successively, the trajectory of the diffusing bead can be reconstructed. Besides the experimental realisation, the characterisation of the setup in terms of the spatial and temporal accuracy as well as the experimental shortcomings that influences the measured trajectories and hence, the interpretation of the data, were also the main topics of this work. For this purpose a reference sample of 20nm sized beads in glycerol was used. The accuracies were studied mainly by computer simulations and the artifacts by experiments. The technical details of the setup and the characterisation results were published (publication P1). The recorded trajectories were analysed with various methods, among which the commonly used mean squared displacement (MSD) yields the results with highest information. The diffusion coefficient as well as the diffusion behaviour could be quantified. With this method the obtainable accuracy in measuring the diffusion coefficient by the acquisition of single-particle trajectories was studied as a function of the length of the trajectories and as a function of the number of fitting points that were used for a linear fit to the experimentally determined MSD-curves. As expected, the relative error of the determined diffusion coefficient gets better for longer trajectories. Further, an optimal number of fitting points for the linear approximation to the MSD-curves was found, which yields the most exact values for the diffusion coefficients and which is independent of the trajectory length. For the first time, experimental results on that issue were compared with theoretical predictions, where a good agreement was found. These findings were published (publication P2). By the use of the Stokes-Einstein relation the diffusion coefficients could further be converted to particle radii. A closer examination of these radii emphasises the influence of the afore mentioned number of fitting points. For the optimal value, significantly precise radii could be determined. Finally, an application of the new setup is presented. In cooperation with the chair of experimental physics I (group of Prof. Dr. M. Weiss) of the University of Bayreuth, the diffusion behaviour of single nanoparticles in a complex fluid was studied. Background hereto is the investigation of biochemical reactions in a biological cell, whose kinetic is given by the diffusion of the corresponding reaction partners. Due to the high crowding of the cell compartments the diffusion is hindered. The diffusion behaviour in these systems is called anomalous and more exactly subdiffusive. Several theoretical models have been developed to explain this phenomenon, but yet without experimental verifications. Here, the diffusion of 50nm sized polymer beads in the model system dextran (a highly branched biopolysaccaride) is investigated experimentally with high spatial and temporal resolution. The data were analysed in the group of the cooperation partner which yields a very good agreement with the model of “fractional Brownian motion”. These results were also published (publication P3).

Abstract in weiterer Sprache

In dieser Dissertation wird die Entwicklung und experimentelle Umsetzung eines optischen Aufbaus zur Messung von zweidimensionalen Trajektorien einzelner fluoreszenzmarkierter Polystyrolbeads mit einem Durchmesser von 20nm bzw. 50nm mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung vorgestellt. Durch die Kombination von Einzelmolekülfluoreszenztechniken mit einer neuartigen Methode mit der englischen Bezeichnung „single-particle orbit tracking“ konnte eine räumliche Auflösung in der Positionsbestimmung der Beads von weniger als 10nm bei einer Zeitauflösung von 4 ms erzielt werden. Die Idee dabei ist, das Anregungslicht räumlich und zeitlich zu manipulieren, um die Position eines Teilchens zu bestimmen. Dazu werden spezielle optische Bauelemente verwendet die einen Laserstrahl auf einen Kegelmantel ablenken. Nachfolgend wird dieser rotierende Laserstrahl mit Hilfe eines Mikroskops in die Probe mit den diffundierenden Teilchen projiziert. Aufgrund der räumlichen und periodischen Modulation des Anregungslichts ist auch das Emissionssignal des Teilchens mit der Frequenz des rotierenden Laserfokus moduliert. Die Amplitude des modulierten Emissionssignals ist von der Teilchenposition innerhalb des Orbits abhängig, welcher durch das fokussierte Anregungslicht erzeugt wird. Ein speziell entwickelter Algorithmus berechnet die Teilchenposition bezüglich des Mittelpunktes des Orbits indem das Emissionssignal demoduliert wird. Anschließend wird das Teilchen um den berechneten Wert zurück in die Mitte des Orbits verschoben. Sukzessive Anwendung dieser Berechnungsmethode liefert die rekonstruierte Trajektorie des Teilchens. Schwerpunkt dieser Arbeit war neben der technischen Realisierung, die Charakterisierung des Aufbaus in Bezug auf die räumliche und zeitliche Auflösung der Trajektorien, sowie auf experimentelle Unzulänglichkeiten, welche die gemessenen Trajektorien und damit auch die Interpretation der Messdaten, beeinflussen. Dazu wurde die Referenzprobe von 20nm großen Teilchen in Glycerin verwendet. Die erreichbaren Auflösungsgrenzen wurden hauptsächlich durch den Einsatz computergestützter Simulationen verifiziert, wohingegen die Artefakte experimentell untersucht wurden. Die diesbezüglich erzielten Ergebnisse sowie die technischen Details des Aufbaus wurden veröffentlicht (Publikation P1). Die aufgenommenen Trajektorien wurden auf verschiedene Weise analysiert, wobei die weitverbreitete Methode des mittleren Verschiebungsquadrats (engl.: mean squared displacement, MSD), Ergebnisse mit dem höchsten Informationsgehalt lieferte. Sowohl der Diffusionskoeffizient als auch das Diffusionsverhalten konnte quantifiziert werden. Mit Hilfe dieser Analyse wurde die erreichbare Genauigkeit von Diffusionskoeffizienten durch Messungen von Einzelteilchentrajektorien in Abhängigkeit der Trajektorienlänge und der Anzahl an Fitpunkten, die für eine lineare Kurvenanpassung an die experimentell bestimmten MSD-Kurven verwendet wurde, untersucht. Die Analyse der Messdaten zeigte erwartungsgemäß, dass der relative Fehler des Diffusionskoeffizienten für längere Trajektorien kleiner ist. Weiterhin wurde eine optimale Anzahl an Fitpunkten für die MSD-Kurvenanpassung gefunden, die unabhängig von der Trajektorienlänge ist und die genauesten Werte für die Diffusionskoeffizienten liefert. Die experimentellen Ergebnisse dieser Untersuchung wurden erstmals mit theoretischen Vorhersagen verglichen, wobei eine gute Übereinstimmung gefunden wurde. Die Resultate wurden veröffentlicht (Publikation P2). Mit Hilfe der Stokes-Einstein Beziehung konnten weiterhin die Diffusionskoeffizienten in Teilchenradien umgerechnet werden. Eine genaue Betrachtung der Radien verdeutlicht den Einfluss der Anzahl an Fitpunkten. Für die optimale Anzahl an Fitpunkten wurden wesentlich präzisere Werte ermittelt. Als Anwendung des neuen Aufbaus wurde in Kooperation mit dem Lehrstuhl Experimentalphysik I (Arbeitsgruppe von Prof. Dr. M. Weiss) der Universität Bayreuth das Diffusionsverhalten von einzelnen Polystyrolbeads in einer komplexen Flüssigkeit studiert. Hintergrund hierbei ist die Untersuchung biochemischer Reaktionen innerhalb einer biologischen Zelle, deren Kinetik durch die Diffusion der entsprechenden Reaktionspartner gegeben ist. Diese Diffusion ist durch die hohe Dichte an Zellkompartimenten stark eingeschränkt. Man spricht deshalb von einem anomalem Diffusionverhalten, genauer gesagt von Subdiffusion. Verschiedene theoretische Modelle zur Beschreibung dieses Phänomens wurden entwickelt, wobei eine experimentelle Verifikation noch nicht möglich war. In dieser Arbeit wird die Diffusion von 50nm großen Polystyrolbeads in dem Modellsystem Dextran (hochverzweigtes Biopolysaccharid) mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung untersucht. Die Messdaten wurden in der Arbeitsgruppe des Kooperationspartners analysiert und zeigten eine sehr gute Übereinstimmung mit dem Modell „fractional Brownian motion“. Die Ergebnisse wurden ebenfalls veröffentlicht (Publikation P3).