Diffusion of proteins inside crowded structures generated using microemulsions

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Neubauer, Ralph:
Diffusion of proteins inside crowded structures generated using microemulsions.
Bayreuth , 2013 . - 123 S.
( Dissertation, 2013 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Microemulsions are thermodynamically stable mixtures of water, oil and surfactant. In the case of microemulsions based on sugar surfactants a cosurfactant as an additional component is necessary, most often a short-chain alcohol. In this thesis mainly pure surfactants are used. The focus is on n-nonyl-ß-d-maltosid and n-dodecyl-ß-d-maltosid as model systems for microemulsions based on technical grade surfactants. Depending on the ratio of the components microemulsion form different structures. In the bicontinuous phase continuous oil and water domains are present separated by a surfactant/co-surfactant film. At higher surfactant amounts the bicontinuous structure passes over to a droplet phase. The size of these structures is in the scale of up to 100nm, therefore microemulsions look transparent for the human eye. Bicontinuous microemulsions are a promising carrier medium for decontamination applications. Chemical warfare agents are mainly lipophilic, in contrast degradation agents are hydrophilic. A microemulsion is able to solubilize lipophilic and hydrophilic molecules. At the interface the warfare agent is close to the degradation agent and can be eliminated. The protein diisopropyl-fluorophosphatase (DFPase) is a promising candidate for decontamination applications and is able to degrade different warfare agents. Therefore, the knowledge of the dynamics and properties of enzymes inside a bicontinuous structure is of big importance. In this thesis different microemulsion systems based on C9G2 or C12G2, water, cyclohexane and 1-pentanol are systematically characterized by X-ray and neutron scattering experiments. By using an improved Green Fluorescent Protein (GFP+) as a counterpart of DFPase with a similar size, the diffusion inside a microemulsion can be studied with the fluorescence correlation spectroscopy (FCS) method. Here, fluorescent impurities in the used components are a problem. By the choice of a suitable concentration of GFP+ and regarding the dynamics of the microemulsion structure, it could be shown that the protein is able to move inside the microemulsion structure. Hence, microemulsions are interesting model systems to produce crowding effects in a controlled way. This is probably the most important result of this thesis. In the C9G2 system a bicontinuous phase is present. At small oil/water ratios o/w with a high water amount big water domains exist with length scales of approximately 10nm, which allows protein diffusion. With increasing oil/water ratio the protein diffusion is more and more hindered. This results in an increase of the diffusion time and a decrease of the anomalous diffusion exponent. At even higher oil/water ratios the diffusion of the protein is nearly identical with the microemulsion dynamics. The length scales are too small to allow protein diffusion, therefore it is stuck in the structure. The C12G2 system shows an oil-in-water droplet phase which also hinders the GFP+ diffusion due to crowding effects. For small oil/water ratios nearly free diffusion is present, at o/w = 0.3 - 0.5 the diffusion is hindered, the anomalous diffusion exponent decreases. At o/w = 0.6 the protein diffusion reflects the microemulsion dynamics. Again at higher values of o/w, GFP+ is stuck in the structure because of the high oil fraction. Two microemulsion systems with different structures were studied, which allow protein diffusion due to their length scales. These results are related to applications: For the formulation of decontamination media the knowledge of the dynamics of the decontaminating protein is of importance. Moreover, pure surfactants can be easily replaced by technical grade surfactants. This enables cheap systems for a production-scale. Furthermore, the situation in living cells can be simulated by a microemulsion structure, where a confined diffusion is present as well. Additional neutron spin echo experiments emphasize the complexity when studying a microemulsion system based on four components. The contrast matching procedure, which is necessary when protein dynamics inside the microemulsion are investigated, is very difficult and requires a high amount of surfactant.

Abstract in weiterer Sprache

Mikroemulsionen sind thermodynamisch stabile Mischungen aus Öl, Wasser und Tensid. Im Falle vonMikroemulsionen auf Zuckertensidbasis wird zusätzlich ein Cotensid benötigt, in den meisten Fällen einkurzkettiger Alkohol. In dieser Arbeit werden überwiegend reine Tenside verwendet, das Hauptaugenmerk liegt dabei auf n-Nonyl-ß-d-Maltosid (C9G2) und n-Dodecyl-ß-d-Maltosid (C12G2) als Modellsystem für Mikroemulsionssysteme mit technischen Zuckertensiden. Mikroemulsionen können je nach Zusammensetzung der Komponenten verschiedene Strukturen ausbilden. In der bikontinuierlichen Phase liegen kontinuierliche Öl- und Wasserdomänen vor, die durch einen Tensidfilm getrennt werden. Bei höheren Tensidanteilen geht die bikontinuierliche Struktur in eine Öl-in-Wasser bzw. Wasser-in-Öl Tröpfchenstruktur über, je nach vorliegendem Öl/Wasserverhältnis. Die Größenordnung von Strukturen in Mikroemulsionssystemen liegt im Bereich von einigen nm bis zu 100nm, weswegen sie optisch transparent erscheinen. Bikontinuierliche Mikroemulsionen sind ein vielversprechendes Trägermittel für Dekontaminationsanwendungen. Chemische Kampfstoffe sind überwiegend lipophiler Natur, wohingegen übliche Dekontaminationsmittel hydrophilen Charakter besitzen. Eine Mikroemulsion ist in der Lage, sowohl liphophile als auch hydrophile Moleküle zu solubilisieren. An der Grenzfläche können Kampfstoff und Dekontaminationsmittel interagieren, der Kampfstoff kann somit abgebaut werden. Das Protein DFPase ist ein aussichtsreicher Kandidat für Dekontaminationsanwendungen und ist fähig, verschiedene Kampfstoffe unschädlich zu machen. Deswegen ist es von großem Interesse, die Dynamiken und Eigenschaften dieses Enzyms innherhalb einer bikontinuierlichen Struktur zu erforschen. In dieser Arbeit werden zwei verschiedene Mikroemulsionssysteme basierend auf C9G2 bzw. C12G2, Wasser, Cyclohexan und 1-Pentanol mit Röntgen- und Neutronenstreuung systematisch charakterisiert. Mit Hilfe des grün fluoreszierenden Proteins in einer verbesserten Version mit erhöhter Fluoreszenz (GFP+) als Pendant zur DFPase mit ähnlicher Größe kann die Diffusion eines Tracer-Proteins mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie innerhalb einer Mikroemulsion untersucht werden. Dabei stellen fluoreszierende Verunreinigungen in den verwendeten Komponenten ein Problem dar. Durch geeignete Wahl der Konzentration von GFP+ in der Mikroemulsion und durch Berücksichtigen der Eigendynamik der Mikroemulsion konnte gezeigt werden, dass sich das Protein innerhalb der Mikroemulsionsstruktur bewegt. Damit stellen Mikroemulsionen interessante Systeme dar, um in kontrollierter Weise “crowding” Effekte zu produzieren und zu untersuchen. Dies ist vermutlich das wichtigste Ergebnis der vorliegenden Arbeit. Im C9G2-System liegt eine bikontinuierliche Phase vor. Bei geringen Öl/Wasser-Verhältnissen o/w mit hohemWasseranteil existieren großeWasserdomänen mit Längenskalen von ca. 10nm, die eine Proteindiffusion erlauben. Für steigende Öl/Wasserverhältnisse wird durch kleinere Wasserdomänen die Proteindiffusion zunehmend eingeschränkt, was sich in einer Vergrößerung der Diffusionszeiten und in einer Verringerung des anormalen Diffusionsexponenten zeigt. Bei höheren o/w ist die Diffusionszeit nahezu identisch mit der Dynamik der Mikroemulsion. Dies ist mit dem Festsitzen des Proteins in der Mikroemulsionsstruktur zu erklären, die Längenskalen sind zu gering für eine selbstständige Diffusion. Im C12G2-System hat man eine Öl-in-Wasser Tröpfchenphase, die wiederum die GFP+-Diffusion innerhalb der kontinuierlichen Wasserphase durch Crowding-Effekte einschränkt. Beobachtet man bei geringen o/w noch nahezu ungehinderte Diffusion, wird diese ab o/w 0.5 erheblich eingeschränkt, um dann ab o/w 0.6 in eine der Mikroemulsionsdynamik entsprechende Diffusion überzugehen. Somit wurden in der vorliegenden Arbeit zwei Modellsysteme mit unterschiedlichem Strukturverhalten erforscht, die aufgrund ihrer Längenskalen die Diffusion des verwendeten Proteins GFP+ erlauben. Diese Ergebnisse sind relevant für verschiedene Anwendungen: Für die Formulierung von Dekontaminationsmedien ist die Kenntnis der Dynamik des dekontaminierenden Proteins von großer Wichtigkeit. Außerdem können reine Tenside leicht durch technische erstezt werden, dies ermöglicht günstige Systeme für einen größeren Produktionsmaßstab. Darüberhinaus kann mit Mikro-emulsionen die Situation innerhalb Zellen simuliert werden, wo ebenfalls oft eine eingeschränkte Proteindiffusion vorliegt. Zusätzlich durchgeführte Neutronen-Spinecho Messungen verdeutlichen die Komplexität von Untersuchungen an einem Zuckertensid-Mikroemulsionssystem mit vier Komponenten. Dabei ist die nötige Angleichung des Streukontrasts durch Variation der Deuterierung der Komponenten überaus kompliziert.