Inter- und intramolekulare Assoziationsreaktionen als zentrale Prozesse im Verlauf der Faltung und Stabilisierung von Proteinen

Titelangaben

Hoffmann-Thoms, Stephanie:
Inter- und intramolekulare Assoziationsreaktionen als zentrale Prozesse im Verlauf der Faltung und Stabilisierung von Proteinen.
Bayreuth , 2012
( Dissertation, 2012 , Universität Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT)

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Abstract

Für die Infektion von E. coli Zellen benötigt der filamentöse Phage fd sein aus drei Domänen bestehendes Gen-3-Protein (G3P). Die C-terminale Domäne verankert das G3P in der Phagenhülle, die N-terminalen Domänen N1 und N2 vermitteln die initialen Schritte der Infektion. Im Ruhezustand des Phagen liegen N1 und N2 in assoziierter Form vor, wodurch die Bindungsfläche auf der N1-Domäne für den sekundären Rezeptor, die C-terminale Domäne von TolA, blockiert wird. Zur Aktivierung des G3P interagiert der Phage über seine N2-Domäne mit dem F-Pilus der Wirtszelle wodurch die für die Assoziation der Domänen wichtige Gelenkregion entfaltet und das dort befindliche Pro213 in die trans-Konformation übergeht. Die Lebenszeit des aktiven Zustandes wird limitiert durch die Reisomerisierung von Pro213, die jedoch sehr langsam abläuft. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, welche Bereiche für die Population des offenen bzw. geschlossenen Zustandes und damit die Funktionalität des G3P wichtig sind. Über die Analyse des Faltungsmechanismus des Wildtyp G3P, sowie der Stabilität und Struktur seines Intermediates mittels NMR-Spektroskopie, konnte gezeigt werden, dass die Gelenkregion in der aktiven Form komplett entfaltet vorliegt. In der Variante G3P IIHY, die unter anderem in der Gelenkregion zwei stabilisierende Substitutionen enthält, sind dagegen die Domänen im Intermediatszustand noch lose miteinander assoziiert. Die Unterschiede in der Stärke der Domänenassoziation beeinflussen die Wechselwirkung der entsprechenden G3P-Varianten mit TolAC, was in vitro anhand von Bindungsexperimenten nachgewiesen werden konnte. Sowohl im aktiven Intermediat, als auch in der nativen Form führen stabilisierende Austausche zu einer deutlichen Verschlechterung der Interaktionsfähigkeit des G3P mit TolAC. Dies wurde zusätzlich durch Infektionsexperimente sowohl mit pilusfreien, als auch mit pilushaltigen Zellen bestätigt. Die Analyse der Stabilität und des Faltungsmechanismus der P213G-Variante des fd G3P zeigt, dass auch Pro213 die Stabilität des inaktiven Ruhezustandes und damit die Lebensdauer der aktiven Form beeinflusst. Aufgrund des Verlustes des Prolinschalters liegt das entsprechende G3P P213G zum großen Teil in nicht assoziierter und damit instabiler Form vor. Durch den Austausch der beiden zu Pro213 benachbarten Reste sind die N-terminalen Domänen ebenfalls fast vollständig unabhängig voneinander, was unter anderem auf die beschleunigte Isomerisierung an Pro213 zurückgeführt werden kann. Um zu analysieren, welche Bereiche des G3P an der Weiterleitung des Signals der Bindung von N2 an den Pilus beteiligt sind, wurden verschiedene Substitutionsvarianten hergestellt, thermodynamisch charakterisiert und die Infektiositäten der entsprechenden Phagenvarianten untersucht. Dabei zeigte sich, dass die erste Schleife der N1-Domäne, die sich in der Interaktionsfläche zur N2-Domäne befindet, eine wichtige Rolle spielt. Nach Ersatz durch eine kürzere Schleife liegen N1 und N2 fast vollständig dissoziiert vor, wie unter anderem aus der Analyse der Affinität gegenüber TolAC sowohl in vitro als auch in vivo hervorgeht. Während der Aktivierung müssen im Umkehrschluss auch die Wechselwirkungen zwischen der Schleifenregion von N1 und N2 gelöst werden. Aufgrund der hohen Stabilität seines G3P im Ruhezustand wird der fd Phage als Grundlage des PROSIDE-Selektionsverfahrens verwendet, um stabilisierte Proteinvarianten zu erhalten. Für das Gb1-Protein aus Streptococcus sp. wurden darüber unter anderem vier stark stabilisierende hydrophobe Austausche identifiziert, die in der Variante Gb1-M2 kombiniert wurden. In der vorliegenden Arbeit wurde die Stabilität dieser hyperstabilen Variante näher analysiert. Die relativ zum WT-Gb1 deutlich erhöhte Stabilität von Gb1-M2 ist dabei zum Teil durch deren Dimerisierung bedingt. Die Kristallstruktur des Proteins zeigt, dass die Assoziation der Monomere über die Ausbildung eines intermolekularen b-Faltblattes und eine hydrophobe Interaktionsfläche vermittelt wird. Der Kern dieser Assoziationsfläche wird durch Leucinreste an den Positionen 16 und 37 gebildet. Die Untersuchung weiterer Varianten hat gezeigt, dass die Kombination von hydrophoben Resten an diesen Positionen zur Dimersierung führt. Um den Beitrag der Austausche zur konformationellen Stabilität des Monomers von Gb1-M2 zu bestimmen, wurde dessen Faltungsmechanismus mittels Einzel- und Doppelmischexperimenten analysiert. Die Faltung des Monomers konnte dabei von der Einstellung des Monomer-Dimer-Gleichgewichtes getrennt und seine Stabilität bestimmt werden. Diese ist gegenüber dem WT-Gb1 deutlich erhöht. Eine solche kinetische Analyse kann allgemein für oligomere Proteine verwendet werden, um die Stabilität ihrer monomeren Form zu ermitteln. Voraussetzung ist, dass, wie in Gb1-M2, die Faltung des Monomers schneller abläuft als die Einstellung des Monomer-Oligomer-Gleichgewichtes.

Abstract in weiterer Sprache

Infection of E. coli cells by the filamentous phage fd is mediated by its gene-3-protein, which consists of three domains. The C-terminal domain is responsible for anchoring the protein in the phage coat, whereas the two N-terminal domains (N1 and N2) perform the initial infection steps. In the inactive resting state, N1 and N2 are tightly associated. However, these interactions block the binding site for the secondary receptor, the C terminal domain of the TolA protein. Activation of the phage is realized by initial binding of domain N2 to the tip of the F pilus on the host cell surface. This results in local unfolding of the hinge region, mediating the dissociation of N1 and N2, and cis/trans isomerization of Pro213 within the hinge. The lifetime of the binding-competent form is limited by the very slow re-isomerization of Pro213. In the thesis presented here, the role of different structural regions for the population of the open and closed state of the G3P was investigated. In the active form of wild type G3P, N1 and N2 are virtually independent of each other and the hinge region is completely unfolded. This could be shown by analysis of the structure and stability of its folding intermediate using NMR spectroscopy and by solving the folding mechanism of the G3P. In the stabilized variant G3P IIHY, the presence of two strongly stabilizing substitutions in the hinge enables the N-terminal domains to loosely associate in the open state. The differences in domain interactions have a significant impact on the affinity of the G3P variants towards TolAC. In vitro binding experiments using energy transfer showed that a highly stable hinge region is only beneficial for the maintenance of the resting state. For G3P IIHY the affinity of both the closed, inactive form and the active intermediate towards TolAC is strongly reduced due to additional stabilizing replacements in its hinge region. These observations were confirmed by infection experiments with F pilus bearing cells as well as F pilus deficient cells. Analysis of the stability and the folding mechanism of the P213G variant of G3P revealed that Pro213 also strongly influences the stability of the resting state and therefore the lifetime of the active phage. The loss of the proline switch leads to the population of the active but unstable form in which N1 and N2 are almost completely dissociated. Replacing the residues adjacent to Pro213 by Alanin also resulted in decoupling of N1 und N2 mainly due to the strongly accelerated conformational change at Pro213. In order to identify those structural elements, which are responsible for transducing the signal of the binding of N2 to the pilus, several G3P variants were created. Thermodynamic characterization of the purified proteins and functional analysis of the corresponding phages showed that the first loop of N1, which is located at the domain interface, has a strong influence on G3P stability as well as functionality. Substitution of this region led to almost complete dissociation of N1 and N2. This was demonstrated by the estimation of the affinity towards TolAC in vitro as well as in vivo and implies that for G3P activation the interaction between the loop of N1 and the N2 domain must be abolished. Due to the high thermal stability of its locked G3P, phage fd is used in the in vitro Proside selection procedure to identify strongly stabilized proteins. For the b1 domain of the streptococcal protein G, among others, four strongly stabilizing substitutions could be selected using this method. The combination of these hydrophobic substitutions resulted in the hyperstable variant Gb1 M2, the stability of which was investigated in detail using CD spectroscopy, calorimetry and analytical ultracentrifugation. The analysis showed that the strongly increased stability of this variant is partially caused by formation of dimers. This could be verified by solving the crystal structure of the Gb1-M2 protein. Besides the formation of an intermolecular b-sheet, the association of the molecules is mainly mediated by a hydrophobic interaction surface, the core of which is formed by leucine residues at positions 16 and 37. Investigation of further Gb1 variants revealed that the combination of the hydrophobic substitutions at these positions is sufficient for dimer formation. In order to estimate the contributions of the substitutions to the conformational stability of monomeric Gb1-M2, single and double mixing experiments were combined to solve the folding mechanism of the protein. The stability of monomeric Gb1-M2, which could be calculated on the basis of its folding kinetics, is strongly increased relative to wild type Gb1. Thus, this kinetic approach cannot only be used to estimate the stability of the monomeric form of dimeric Gb1 variants but also of other oligomeric proteins. The prerequisite is that folding of the monomer is much faster than the adjustment of the monomer/dimer equilibrium.