Struktur-Funktionsbeziehungen und Inhibition retroviraler Reverser Transkriptasen

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Schneider, Anna:
Struktur-Funktionsbeziehungen und Inhibition retroviraler Reverser Transkriptasen.
Bayreuth , 2015 . - VI, 120 S.
( Dissertation, 2015 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Das Enzym Reverse Transkriptase (RT) ist für den retroviralen Lebenszyklus von entscheidender Bedeutung. Die RT aus dem Humanen Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) ist ein Heterodimer bestehend aus den Untereinheiten p66 und p51. Im Gegensatz hierzu besitzen Foamy Viren (FVs) wie das Affen Foamy Virus aus Makaken (simian foamy virus of macaques, SFVmac) eine Protease (PR)-Domäne am N-Terminus des reifen monomeren PR-RT Enzyms. Alle retroviralen RTs beinhalten eine N-terminale Polymerase- und eine C-terminale Ribonuklease H (RNase H)-Domäne. Die Polymerasedomäne kann in die Handflächen-, Finger-, Daumen- und Verbindungssubdomäne unterteilt werden. Letztere verbindet die Polymerasedomäne mit der C-terminalen RNase H. Während der Reversen Transkription schreibt die RT die genomische virale RNA in doppelsträngige DNA um. Hierbei katalysiert die Polymerasedomäne die DNA-Synthese und der RNA-Strang im entstehenden RNA/DNA-Hybrid wird von der RNase H geschnitten. Damit sind beide, die RNase H- und Polymeraseaktivität für die retrovirale Vermehrung unerlässlich und stellen wichtige Angriffsziele für die antiretrovirale Therapie dar.

Genaue Kenntnisse über die Grenzen und Funktionen von (Sub)-Domänen in der SFVmac PR-RT sind wichtig für strukturelle und mechanistische Studien mittels der Kernspinresonanz (Nuclear Magnetic Resonance, NMR)-Spektroskopie. Deshalb wurde der Einfluss von (Sub)-Domänendeletionen auf die strukturelle Stabilität und enzymatische Aktivität der SFVmac PR-RT untersucht. Sowohl Deletionen der RNase H-Domäne als auch der Verbindungssubdomäne beeinträchtigten beide, durch eine Abnahme der Substratbindungsaffinität oder strukturellen Stabilität, die katalytische Aktivität der Polymerasedomäne. Außerdem erwies sich die Aminosäureregion 107-143 am N-Terminus der RT ebenfalls als wichtig für die katalytische Aktivität und strukturelle Integrität der Polymerase. Die Aktivierung der viralen Protease (PR) erfolgt durch Bindung der PR-RT an das virale RNA-Motif PARM. PR-RTs bei denen die RNase H-Domäne deletiert war, waren nicht mehr zur PR-Aktivierung in der Lage. Darüber hinaus muss die proteolytische Spaltung von Gag vor der Reversen Transkription abgeschlossen sein.

Azidothymidin (AZT) ist ein nukleosidischer Inhibitor, der die RT-Aktivität von HIV-1 und SFVmac in vivo und in vitro inhibiert. Die Resistenz gegen AZT basiert in beiden Viren auf einem ATP-vermittelten Ausbaumechanismus von bereits eingebautem AZT-Monophosphat (AZTMP). In der SFVmac PR-RT verleihen die vier Substitutionen K211I, I224T, S345T und E350K maximale Resistenz gegen AZT. Um die Bedeutung der einzelnen Substitutionen für den Resistenzmechanismus aufzuklären, wurden PR-RT-Varianten mit ausgewählten Kombinationen der vier Aminosäureaustausche biophysikalisch und biochemisch untersucht. Der Austausch I224T ist ein Polymorphismus mit keinem Effekt auf die AZT-Resistenz an sich. Die Substitution K211I änderte nicht nur die enzymatischen Eigenschaften der PR-RT, wie die katalytische Aktivität und Einbaugenauigkeit von Nukleotiden, sondern verdoppelte auch die Ausbaueffizienz in Anwesenheit von S345T und E350K. NMR-spektroskopische Experimente mit einer verkürzten Polymerasedomäne (RTshort), bestehend aus den Subdomänen Finger und Handfläche, zeigten keine ATP-Bindung in der Wildtyp-RTshort. Im Gegensatz hierzu war die RTshort-mt4, mit allen vier Resistenzsubstitutionen in der Lage ATP mit einem KD-Wert von etwa 7.6 mM zu binden. Dabei ist S345T die wichtigste Substitution für den AZTMP-Ausbau, da sie eine hochaffine Bindungstasche für das ATP, vermutlich infolge einer Reorientierung eines bereits vorhandenen Tryptophanrestes, erzeugt.

Die RNase H-Domäne der HIV-1 RT ist ein neues Angriffsziel antiretroviraler Medikamente. Obwohl zahlreiche RNase H Inhibitoren (RHIs) bereits synthetisiert wurden, existieren nur wenige Studien über die Bindungsstellen dieser Inhibitoren. Deshalb war es unser Ziel, ein neues Modellsystem für Bindungsanalysen von HIV-1 RHIs, mit der RNase H aus dem Prototypischen FV (prototype foamy virus, PFV) zu etablieren. Zuerst zeigten wir, dass HIV-1 RHIs einen vergleichbaren inhibitorischen Effekt auf die PFV RNase H-Aktivität der gesamten PR-RT ausüben, was auf ähnliche Bindungstaschen in beiden Enzymen schließen lässt. In einem zweiten Schritt führten wir NMR-Titrationsexperimente des Mg2+-komplexierenden Inhibitors RDS1643 und der isolierten PFV RNase H-Domäne durch. Basierend auf unseren NMR-Ergebnissen wurde eine in silico Modellierung durchgeführt, um eine potentielle Bindungsstelle für das RD1643 in der PFV RNase H zu identifizieren. Die Bindungsregion neben dem aktiven Zentrum erlaubt Wechselwirkungen mit Mg2+ und enthält eine hydrophobe Kavität für den aromatischen Teil des Inhibitors. Aufgrund der hohen Strukturhomologie zwischen den RNase H-Domänen aus HIV-1 und PFV war es möglich eine äquivalente RDS1643-Bindungstasche in der HIV-1 RNase H zu definieren.

Abstract in weiterer Sprache

The enzyme reverse transcriptase (RT) is pivotal for the life cycle of retroviruses. The RT from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) is a heterodimer with the subunits p66 and p51. In contrast, foamy viruses (FVs) such as the Simian Foamy Virus of macaques (SFVmac) harbor the protease (PR) domain at the N-terminus of the mature monomeric PR-RT enzyme. All retroviral RTs consist of a N-terminal polymerase and a C-terminal ribonuclease H (RNase H) domain. The polymerase domain can be subdivided into the palm, fingers, thumb and connection subdomains. The latter links the polymerase domain to the C-terminal RNase H. During reverse transcription the RT converts genomic viral RNA in double stranded DNA. While DNA synthesis is catalyzed by the polymerase domain, the RNA in the emerging RNA/DNA hybrid is degraded by the RNase H domain. Both RNase H and polymerase activity are indispensable for retroviral replication and represent important targets for antiretroviral therapy.

Precise knowledge on boundaries and functions of the (sub)-domains within the SFVmac PR-RT is important for structural and mechanistic (sub)-domain studies via nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Thus we examined the impact of (sub)-domain truncations on structure stability and catalytic activity of the SFVmac PR-RT. Deletions of the RNase H domain as well as the connection subdomain both impaired the catalytic activity of the polymerase domain, due to a decrease in substrate binding affinity or structural stability. Moreover, the amino acid region 107-143 at the N terminus of the RT was also important for the catalytic activity and structural integrity of the polymerase. Activation of the viral PR requires binding of the PR-RT to the viral RNA motif PARM. PR-RTs whose RNase H domain was deleted resulted in a complete loss of PR activation. Furthermore proteolytic cleavage of Gag must be completed before reverse transcription.

Azidothymidine (AZT) is a nucleoside inhibitor known to inhibit the RT activity of HIV-1 and SFVmac in vivo and in vitro. In both viruses the resistance against AZT is based on an ATP mediated excision mechanism of the incorporated AZT-monophosphate (AZTMP). In SFVmac PR-RT the four substitutions K211I, I224T, S345T and E350K confer high AZT-resistance. To elucidate the function of each substitution in the resistance mechanism, PR-RT variants containing selected combinations of the four substitutions were investigated biophysically and biochemically. The exchange I224T is a polymorphism with no effect on AZT resistance per se. However, substitution K211I not only altered the enzymatic properties of the PR-RT, i.e. catalytic activity and fidelity, but also doubled the excision efficiency in the presence of S345T and E350K. NMR spectroscopy experiments with a truncated polymerase domain (RTshort), composed of the fingers and palm subdomains revealed no ATP-binding in wild type RTshort. In contrast RTshort-mt4, harboring all four resistance substitutions, was able to bind ATP with a KD-value of ca. 7.6 mM. Here, S345T was the most important substitution for AZTMP-excision, since it created a high-affinity binding site for ATP, probably owing to the reorientation of an already existing tryptophan residue.

The RNase H domain of HIV-1 RT is a new target for antiretroviral drugs. Although numerous RNase H inhibitors (RHIs) have been synthesized, only few studies exist on the binding sites of inhibitors. Therefore, we wanted to establish a new model system for the binding analysis of HIV-1 RHIs, using prototype FV (PFV) RNase H. First, we showed that HIV-1 RHIs have a comparable inhibitory effect on the PFV RNase H activity of the full length PR-RT, indicating pocket similarity in the two enzymes. In a second step we performed NMR titration experiments of the Mg2+ chelating inhibitor RDS1643 with the isolated PFV RNase H domain. Based on our NMR results in silico docking was used to identify a putative RDS1643 binding site in PFV RNase H. The binding region next to the active site comprises Mg2+ interactions as well as a hydrophobic cavity for the aromatic inhibitor moiety. Due to the high structural similarities between the RNase H domain of PFV and HIV-1 it was possible to define an equivalent RDS1643 binding site in HIV-1 RNase H.