Spektroskopie an individuellen chlorosomalen Lichtsammelkomplexen des grünen Schwefelbakteriums Chlorobaculum Tepidum

Titelangaben

Jendrny, Marc:
Spektroskopie an individuellen chlorosomalen Lichtsammelkomplexen des grünen Schwefelbakteriums Chlorobaculum Tepidum.
Bayreuth , 2014 . - III,148 S.
( Dissertation, 2014 , Universität Bayreuth, Fakultät für Mathematik, Physik und Informatik)

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Abstract

Chlorosome sind die größten und wichtigsten Lichtsammelkomplexe der grünen Schwefel- und nicht-Schwefelbakterien. Ihre Aufgabe ist die Absorption von Photonen und der Transfer der Energie bis hin zum Reaktionszentrum. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die elektronische Struktur und die exzitonischen Zustände einzelner Chlorosome des Chlorobaculum tepidum Wildtyp und bchR Mutanten untersucht.
Sowohl die Chlorosome des Wildtyp, als auch die des bchR Mutanten wurden durch Absorptions- und Fluoreszenz-Emissionsspektroskopie an Ensembleproben charakterisiert. Einzelne Chlorosome wurden daraufhin bei Raumtemperatur und 1,5 K untersucht. Von jedem der untersuchten Chlorosome wurde eine bestimmte Anzahl von Fluoreszenz-Anregungsspektren aufgenommen und nach jeder Aufnahme wurde die Polarisation der Anregungsstrahlung um einen bestimmten Winkel gedreht. Auf diese Weise wurden polarisationsaufgelöste Fluoreszenz-Anregungsspektren erhalten. Im Gegensatz zu den bei Raumtemperatur aufgenommen polarisationsaufgelösten Fluoreszenz-Anregungsspektren, dessen Durchschnittsspektren breite Banden ohne Besonderheiten aufweisen, zeigen die bei 1,5 K aufgenommenen Spektren ausgeprägte Schultern auf den nieder- oder hochenergetischen Flanken des Maximums der Durchschnittsspektren. Die Analyse der Spektren und der frequenzabhängigen Modulationstiefe zeigt, dass bei tiefen Temperaturen strukturelle Fluktuationen unterdrückt werden und die in Chlorosomen enthaltenen BChl Molekülaggregate in bestimmten Konformationen eingeschlossen werden. Bei Raumtemperaturaufnahmen wird über derartige Konformationen gemittelt und die Spektren erscheinen somit homogener.
Es wurde eine Methode zur globalen Analyse der polarisationsaufgelösten Fluoreszenz-Anregungsspektren in Analogie zu zerfalls-assoziierten Spektren (DAS) entwickelt, über die sogenannte polarisations-assoziierte Spektren PAS erhalten wurden. Bei dieser Analyse wurden die polarisationsaufgelösten Fluoreszenz-Anregungsspektren mit zwei globalen und zwei frequenzabhängigen lokalen Parametern gefittet. An jeder spektralen Position wird das polarisationsaufgelöste Fluoreszenz-Anregungsspektrum mit zwei cos² modulierten Funktionen entlang der Polarisation gefittet. Der Nullphasenwinkel und der Phasenwinkel der cos²-Funktionen sind dabei die globalen Parameter. Die Amplituden der cos²-Funktionen sind die Intensitäten der PAS an der jeweiligen spektralen Position. Sowohl die polarisationsaufgelösten Fluoreszenz-Anregungsspektren der Chlorosome des Wildtyps als auch des bchR Mutanten wurden mittels dieser Methode ausgewertet. Die Analyse der Spektren der Wildtyp Chlorosome liefert breite Verteilungen der spektralen Schwerpunkte der Durchschnittsspektren und der PAS, sowie der Differenz der spektralen Schwerpunkte der PAS. Anders verhält es sich bei den Ergebnissen aus Analyse der Spektren der Chlorosome der bchR Mutanten. In diesem Fall sind die Verteilung verglichen mit denen des Wildtyp eng und deuten auf eine Reduktion der Probenheterogenität. Der Phasenwinkel ist in beiden Fällen eng um ungefähr 90° verteilt, was auf orthogonal zueinander orientierte exzitonische Übergangsdipolmomente der BChl Moleküle hinweist.
Es wurden Computersimulationen verschiedener BChl Molekülaggregate durchgeführt. Für die strukturelle Nahordnung wurde eine Einheitszelle, die durch NMR Experimente gefunden wurde, herangezogen. Die strukturelle Fernordnung wurde durch zwei einzelwandige Zylinder unterschiedlicher Durchmesser, einen doppelwandigen Zylinder, der aus den einzelwandigen Zylinder zusammengesetzt wurde, zwei dreidimensionale Spiralen unterschiedlicher Durchmesser und eine zweidimensionale, planare Lamelle realisiert. Die durch die Simulationen der Aggregatmodelle erhaltenen Spektren sind kompatibel mit den experimentell aufgenommenen Spektren. Im Falle der Wildtyp Chlorosome wurde geschlussfolgert, dass ein Gemisch verschiedener BChl Molekülaggregate im Inneren der Chlorosome enthalten ist und das kleinere Aggregate einen entscheidenden Einfluss haben. Im Falle des bchR Mutanten wurde vermutet, dass hauptsächlich größere Aggregate aufgrund der reduzierten strukturellen Heterogenität das Innere eines Chlorosoms ausfüllen. Nicht-wechselwirkende zweidimensionale, planare Lamellen wurden in beiden Fällen ausgeschlossen. Es muss allerdings erwähnt werden, dass wechselwirkende oder gewellte Lamellenaggregate nicht simuliert wurden und möglicherweise Zwischenräume, die zwischen röhrenartigen Aggregaten entstehen ausfüllen könnten.
Generell wurde gezeigt, das Spektroskopie bei tiefen Temperaturen und an individuellen Komplexen eine potente Methode darstellt, die Eigenschaften aufzeigt, die unter Raumtemperatur- oder Ensembleexperimenten verborgen bleiben. Der Vergleich zwischen experimentellen Befunden und denen numerisch simulierter Modelle ermöglicht Aussagen über die Kompatibilität hypothetischer und realer Pigmentanordnungen.

Abstract in weiterer Sprache

Chlorosomes are the biggest and most important light-harvesting complexes of green sulphur and non-sulphur bacteria. They absorb photons and transfer the energy to the reaction centre. This work covers the investigations of the electronic structure and excitonic states of individual chlorosomes of the Chlorobaculum tepidum wild type and bchR mutant.
Both chlorosomes from the wild type and from the bchR mutant have been characterised by absorption and fluorescence-emission spectroscopy of ensemble samples. Thereupon individual chlorosomes were investigated at room temperature and 1.5 K. In case of each individual chlorosom a certain number of fluorescence-excitation spectra were acquired and after each spectrum the polarisation of the exciting radiation was rotated about a certain angle. Thus polarisation-resolved fluorescence-excitation spectra were obtained. In contrast to the polarisation-resolved fluorescence-excitation spectra that were acquired at room temperature and exhibit broad, featureless bands, the spectra recorded at 1.5 K show pronounced shoulders on the low and high energy flanks of the peak intensity of the average spectrum. The analysis of the spectra and the frequency dependent modulation depth indicate that structural fluctuations are suppressed at low temperature and that aggregates of BChl molecules in the inside of chlorosomes are trapped in certain configurations. The room temperature spectra represent a temporal average over many conformational states and appear more homogeneous.
In analogy to decay-associated spectra (DAS) polarisation-associated spectra (PAS) were obtained by method that was developed to analyse the polarisation-resolved fluorescence-excitation spectra in a global manner. Using this method the polarisation-resolved fluorescence-excitation spectra were fitted with two global and two frequency dependent local parameters. Each spectral position of the polarisation-resolved fluorescence-excitation spectrum was fitted with two cos²-functions as a function of the polarisation. The initial phase and the phase angle of the cos²-functions represent the global parameters. The amplitudes of the cos²-functions accord to the intensities of the PAS at the corresponding spectral position. Both the polarisation-resolved fluorescence-excitation spectra of the wild type and bchR mutant chlorosomes were analysed using this procedure. The evaluation of the wild type chlorosome spectra leads to broad distributions of the spectral centres of gravity (spectral means) of both the average spectrum and of the PAS as well as of the separation of the PASs spectral means. The outcome of the evaluation of the bchR mutant spectra behave contrary to the above mentioned. Here distributions are, compared to the wild type distributions, much narrower and indicate a reduction of the sample heterogeneity. The phase angle is in both cases narrowly distributed around approximately 90° and gives evidence for excitonic transition-dipole moments of the BChl molecules that are aligned orthogonal with respect to each other.
Computer simulations of different aggregates of BChl molecules have been carried out. The basis of the structural short-range order is a unit cell, that was found through NMR experiments. The long-range order was realised by two single wall cylinders of different radii, a double wall cylinder, assembled from the single wall cylinders, two 2-dimensional scrolls (spirals structures) of different radii and a planar sheet. Spectra that were obtained through the simulations of the aggregate structures are compatible with the experimentally acquired spectra. In case of the wild type chlorosomes it was concluded that a mixture of different BChl molecule-aggregates is present in the inside of a chlorosome and that rather smaller aggregates than big ones are present. In case of bchR mutant chlorosomes it was assumed, that mainly large aggregates that also reduce structural heterogeneity fill the inside of chlorosomes. Non-interacting 2-dimensional, planar sheets were excluded in both cases. However, it must be stated, that interacting or undulated sheet structures have not been simulated. It is conceivable that they occupy empty space that occurs between rod-like aggregates.
It has been shown that low temperature spectroscopy of individual complexes is a powerful tool to reveal properties that are hidden at room temperature or averaged out at ensemble experiments. The comparison between experimental results and numerically simulated models allows to find conclusions concerning hypothetical and actual pigment assemblies.