Human cohesin dynamics and their regulation in M and S phase

Titelangaben

Buheitel, Johannes:
Human cohesin dynamics and their regulation in M and S phase.
Bayreuth , 2015 . - 189 S.
( Dissertation, 2015 , Universität Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT)

Volltext

Link zum Volltext (externe URL):

Abstract

Cohesin is a multimeric ring complex, which associates with DNA throughout most of the eukaryotic cell cycle. Its canonical role is to hold the two copies (sister chromatids) of each chromosome together from the time of their generation in S phase until their separation in M phase, thus ensuring the fidelity of mitosis. The complex mediates this so-called cohesion by topologically embracing the sister chromatids inside its ring structure composed of the three subunits Scc1, Smc1 and Smc3. For this thesis, I have studied cohesin's dynamic association with chromatin in M and S phase as well as its role at the mitotic centrosome, the main microtubule-organizing center of most eukaryotic cells.
In order to separate sister chromatids in mitosis, cohesin must be removed from chromosomes. This is ultimately achieved by the action of the cystein protease separase, which cleaves cohesin at the centromeres (the primary constriction site of mitotic chromosomes) to release DNA. In vertebrates, however, the bulk of cohesin molecules, which is located on chromosome arms, is already removed from DNA in the first stage of mitosis, prophase, by a non-proteolytic mechanism called the prophase pathway. Since cohesin embraces the sister chromatids, prophase pathway signaling requires the ring to open up at at least one of its three subunit interaction sites ("gates"). However, which gate opens up for DNA exit has remained enigmatic. The same is true (at least in humans) for cohesin's DNA entry gate, which would be required to open up to topologically reload the ring complex after chromatid separation in telophase. For my thesis, I set out to identify cohesin's DNA exit (prophase) and entry (telophase) gates by employing the so-called FRB/FKBP system, allowing me to artificially close each of cohesin's gates individually in a conditional manner. I found that cohesin's DNA exit gate during prophase is composed of Smc3 and Scc1. To load the complex onto DNA, however, the gate situated between Smc1-Smc3 needs to open up. Utilizing different gates allows for more precise control over cohesin dynamics by maintaing the delicate balance between DNA entry and exit.
Cohesin's association with chromatin remains very dynamic during G1 phase, but has to be stabilized as soon as the second sister chromatid is synthesized in S phase. Today, we know that this so-called cohesion establishment and DNA replication are two tightly co-regulated processes. However, how the replication machinery achieves DNA duplication, while simultaneously depositing the nascent chromatid inside the ring's lumen is still an unsolved problem. Using the aforementioned FRB/FKBP system in combination with an assay allowing me to assess DNA synthesis on a single replication fork level, I set out to determine whether the replisome might be able to pass through the closed ring or whether cohesin has to open up one of its three gates. These experiments revealed that cohesin gate opening unlikely to be required during replication but impaired dynamics of the complex in the preceeding G1 phase causes a dramatic reduction of replication fork velocities in the following S phase, likely by altering cohesin levels on chromatin. While these results confirm a strong correlation between cohesin dynamics and replication, they also argue for a model in which pre-S phase-loaded cohesin complexes represent the future cohesive fraction and, moreover, that during co-replicative cohesion establishment the replisome may pass through the closed cohesin ring.
Finally, we and other groups have shown that cohesin plays a functional role at the centrosomes. Each centrosomes comprises two centrioles, which are rigidly coordinated ("engaged") in a perpendicular fashion. Separase-mediated proteolysis of centrosome- associated cohesin causes centriole disengagement, a prerequisite for centrosome duplication in the following S phase. In a collaboration with Lisa Mohr (University of Bayreuth, Germany), we found that the same factor, which protects centromeric cohesin from prophase pathway signaling until its proteolysis at the metaphase-to-anaphase transition, namely Sgo1, is also required to maintain centriole engagement. More specifically, human cells express a set of Sgo1 splice variants, which exclusively localize and function either at the centromere or the centrosome. Further studies revealed that Sgo1's determinant for centrosomal function lies in its C-terminal 40 amino acids, an area, which we therefore named the "centrosomal targeting signal of Sgo1" or CTS. Nonetheless, Sgo1's centromeric function is conserved at the centrosome, since my results demonstrate that CTS-containing Sgo1 variants protect centrosomal cohesin from the action of the prophase pathway by recruiting protein phosphatase 2 A (PP2A). Our results provide compelling evidence that the cell coordinates chromosome and centrosome cycles by multiple use of proteins like cohesin and its regulatory framework. However, employing specific Sgo1 splice variants allows these two processes to be precisely and individually controlled or maybe even uncoupled under certain circumstances as, for example, during spermatogenesis.

Abstract in weiterer Sprache

Cohesin ist ein multimerer Ring-Komplex, welcher während des größten Teils des eukaryontischen Zellzyklus mit DNA assoziiert. Seine kanonische Funktion besteht darin, die zwei Kopien (Schwester-Chromatide) jedes Chromosoms von der Zeit ihrer Entstehung in der S Phase bis zu ihrer Trennung in der M Phase zusammenzuhalten, um einen korrekten Ablauf der Mitose zu garantieren. Der Komplex vermittelt diese sogenannte Kohäsion durch topologisches Umfassen der Schwester-Chromatide mithilfe seiner Ring-Struktur, welche sich aus den drei Untereinheiten Scc1, Smc1 und Smc3 zusammensetzt. Für diese Arbeit habe ich die dynamische Assoziation Cohesins mit Chromatin in M und S Phase, sowie seine Rolle am mitotischen Zentrosom, dem Haupt- Mikrotubuli-organisierenden Zentrum der meisten eukaryontischen Zellen, untersucht.
Um Schwester-Chromatide in Mitose zu trennen, muss Cohesin von den Chromosomen entfernt werden. Dies wird schlussendlich durch die Aktivität der Cystein- Protease Separase erreicht, welche Cohesin an den Zentromeren (der primären Einschnürung mitotischer Chromosomen) schneidet, um DNA aus dem Ring zu entlassen. In Vertebraten jedoch, wird das Gros der Cohesin-Moleküle, welche an den Chromosomen-Armen lokalisiert, bereits in der ersten Phase der Mitose, der Prophase, durch einen nicht-proteolytischen Mechanismus namens Prophase-Weg entfernt. Da Cohesin die Schwester-Chromatide umschließt, muss der Prophase-Weg ein Öffnen des Rings an mindestens einer der Interaktionsstellen ("gates") zwischen seinen drei Untereinheiten bewirken. Welches gate sich jedoch öffnet, um DNA zu entlassen, verblieb bis heute unklar. Dasselbe lässt sich auch über Cohesins DNA-Eintrittsgate aussagen (zumindest im Menschen), welches sich öffnen müsste, um den Ring-Komplex nach Chromatid-Trennung in Telophase wieder topologisch auf DNA zu laden. Für meine Arbeit plante ich sowohl Cohesins DNA-Austritts- (Prophase) als auch dessen -Eintrittsgate (Telophase) zu identifizieren. Hierfür entschied ich mich für die Verwendung des sogenannten FRB/FKBP-Systems, welches mir erlaubte künstlich jedes Cohesin-gate einzelnd und in konditionaler Weise zu schließen. Ich fand heraus, dass Cohesins DNA- Austrittsgate zwischen Smc3 und Scc1 liegt. Um den Komplex allerdings auf DNA zu laden, muss sich das Smc1-Smc3-gate öffnen. Die Verwendung verschiedener gates erlaubt der Zelle eine exakte Kontrolle der Cohesin-Dynamik durch das Einstellen eines präzisen Gleichgewichts zwischen DNA-Ein- und -Austritt.
Cohesins Chromatin-Assoziation gestaltet sich sehr dynamisch während der G1 phase, muss jedoch stabilisiert werden sobald das zweite Schwester-Chromatid in S Phase synthetisiert wird. Heute wissen wir, dass diese sogenannte Kohäsionsetablierung und DNA-Replikation zwei streng ko-regulierte Prozesse darstellen. Wie jedoch die Replikations-Maschinerie DNA verdoppelt und dabei gleichzeitig das naszierende Chromatid im Ring-Lumen ablegt, stellt immer noch ein ungelöstes Problem dar. Unter Verwendung des zuvor genannten FRB/FKBP-Systems in Kombination mit einem Versuchsaufbau, welcher mir erlaubt DNA-Synthese auf der Ebene einzelner Replikationsgabeln zu untersuchen, plante ich herauszufinden, ob das Replisom durch den geschlossenen Ring hindurchpassieren könnte oder ob Cohesin hierzu eines seiner drei gates öffnen müsste. Diese Experimente zeigten, dass das Öffnen von Cohesin-gates während der Replikation wahrscheinlich nicht notwendig ist, aber auch, dass die Beeinträchtigung der Dynamik des Komplexes in der vorherigen G1 Phase eine dramatische Reduktion der Geschwindigkeit von Replikationsgabeln in der folgenden S Phase, wahrscheinlich aufgrund veränderter Cohesin-Mengen an Chromatin, zur Folge hat. Während diese Ergebnisse eine starke Korrelation zwischen Cohesin-Dynamik und Replikation bestätigen, sprechen sie weiterhin auch für ein Modell, nach welchem vor der S Phase geladene Cohesin-Komplexe bereits die zukünftige kohäsive Fraktion darstellen. Darüber hinaus zeigen sie, dass das Replisom während der ko-replikativen Kohäsionsetablierung durch den geschlossen Cohesin-Ring hindurchpassiert.
Schlussendlich haben wir und andere Gruppen bereits zeigen können, das Cohesin eine funktionale Rolle an den Zentrosomen spielt. Jedes Zentrosom besteht aus zwei Zentriolen, welche fest in einem rechten Winkel zueinander stehend koordiniert ("gekoppelt") sind. Separase-abhängige Proteolyse von zentrosomen-assoziiertem Cohesin verursacht Entkopplung von Zentriolen, was eine Voraussetzung für Zentrosomen-Duplikation in der folgenden S Phase darstellt. In Kollaboration mit Lisa Mohr (Universität Bayreuth) haben wir festgestellt, dass derselbe Faktor, welcher zentromerisches Cohesin bis zu seiner Proteolyse am Metaphase-zu-Anaphase-Übergang vor der Aktivität des Prophase-Wegs schützt, Sgo1, auch benötigt wird, um Zentriolen- Kopplung aufrechtzuerhalten. Genauer gesagt, menschliche Zellen exprimieren eine Reihe von Sgo1-Spleiß-Varianten, welche exklusiv entweder ans Zentromer oder ans Zentrosom lokalisieren und dann auch nur dort wirken. Weitere Versuche zeigten, dass der bestimmende Faktor für die zentrosomale Funktion von Sgo1 in seinen C-terminalen 40 Aminosäuren liegt, welche wir aufgrund dieser Eigenschaft "centrosomal targeting signal of Sgo1" bzw. CTS genannt haben. Trotzdem bleibt die zentromerische Funktion von Sgo1 konserviert, da meine Ergebnisse zeigen können, dass CTS-enthaltende Sgo1- Varianten zentrosomales Cohesin durch Rekrutierung von Protein Phosphatase 2 A (PP2A) vor der Aktivität des Prophase-Wegs schützen. Unsere Ergebnisse liefern überzeugende Beweise dafür, dass die Zelle Chromosomen- und Zentrosomen-Zyklen durch die mehrfache Verwendung von Proteinen wie Cohesin und dessen regulatorischen Umfeld, koordiniert. Jedoch erlaubt der Einsatz spezifischer Sgo1-Spleiß-Varianten die präzise und individuelle Kontrolle dieser zwei Prozesse und unter Umständen sogar ihre Entkopplung in Fällen, wie z.B. der Spermatogenese.