Darstellung von N-Glycanaziden und deren Konjugaten für glycobiologische Untersuchungen

Titelangaben

Boos, Irene:
Darstellung von N-Glycanaziden und deren Konjugaten für glycobiologische Untersuchungen.
Bayreuth , 2016 . - VII, 187 S.
( Dissertation, 2015 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

N-Glycane stellen einer sehr häufige posttranslationale Modifikation von sekretorischen Proteinen dar. Sie beeinflussen die Faltung, Halbwertszeit und Eigenschaften der Glycoproteine maßgeblich. Um die Eigenschaften von N-Glycanen untersuchen zu können, müssen diese entweder isoliert oder durch chemische Synthese bereitgestellt werden. Dabei bietet sich die Nutzung einer anomeren Azidfunktion an, um weitergehende Derivatisierungen der Glycane durchführen zu können.
In dieser Arbeit konnten biantennäre Glycane aus einem Sialoglycopeptid gewonnen werden. Dies konnte sowohl durch die Amidase PNGase F als auch durch die Endoglycosidase S
erreicht werden. Der Einsatz der Endoglycosidase S und eine anschließende Oxazolinbildung führte zu den aktivierten Octa- und Decasaccharid, welche für enzymatische Glycopeptidsynthesen eingesetzt werden konnten.
Weiterhin konnten mannosidischen Glycanazide aus modularen Bausteinen synthetisiert werden. Dabei wurden jeweils hybridische Glycane als Vorstufen hergestellt, die
nach der Entschützung mit einer beta-N-Acetylglucosaminidase verkürzt wurden.
Für die Synthese von Glycokonjugaten wurde die Click-Chemie angewandt. Der Einsatz der Kupfer-katalysierten Cycloaddition mit Alkinen musste jedoch für N-Glycane optimiert werden. Durch den Einsatz wasserlöslicher Liganden konnte der Abbau der N-Glycane umgangen und biotinylierte und Fluorescein-modifizierte Saccharide in guten Ausbeuten erhalten werden. Das Einbringen eines Fluoresceintags ermöglichte Bindungsstudien
von galactosylierten N-Glycanen mit unterschiedlichen Galectinen durch Fluoreszenzpolarisationsmessungen.
Weiterhin konnten N-Glycanazide einfach und schnell mit omega-Aminoalkinen funktionalisiert werden. Eine Bibliothek aminofunktionalisierter Glycane konnte auf aktivierte Glasoberflächen gedruckt und mit Lectinen getestet werden.
Die freien Glycanazide ermöglichten ebenfalls den Zugang zu IL6 43-48 Glycopeptidhydraziden durch Pseudoprolin-vermittelte Lansbury-Aspartylierung. Abschließend konnte durch die Synthese von derivatisierten Glycanen mit einem Lanthanoid-tag die globale Konformation eines biantennären N-Glycans durch NMR-Spektroskopie erstmals in Lösung bestimmt werden.

Abstract in weiterer Sprache

N-glycans are one of the most common posttranslational modifications of proteins. They affect the folding, the regulation of the activity and the half-life of glycoproteins. In order to study the behaviour of homogeneous glycoforms, N-glycans have to be isolated or chemically synthesised. The presence of an anomeric azido group within the saccharide can give access to different glycoconjugates.
In this work biantennary glycans were gained from a sialoglycopeptide. Amidase PNGase F as well as the endoglycosidase S were used to release the biantennary saccharides. The use of Endo S and subsequent oxazoline formation led to deca- and octasaccharides, which were succesfully applied in the enzymatic glycopeptide synthesis.
Moreover, mannosidic glycosyl azides could be yielded by chemical synthesis with a modular building block approach. In each case hybridic glycans were obtained, deprotected over multistage reactions and finally fermented by an beta-N-acetylglucoaminidase.
In order to obtain glycoconjugates, click-chemistry was applied. The use of copper-catalysed cycloaddition was optimised for N-glycans. Two water soluble ligands were synthesised to prevent hydrolysis by different copper species. Thus biotinylated and fluorescein-tagged N-glycans were gained in good yields. The use of a fluorescein-tag allowed binding studies with galectins by fluorescence polarisation measurements. Furthermore, the click-chemistry enabled an easy and quick introduction of amino functionalised spacers to immobilise oligosaccharides on glycan arrays. In cooperation a library of biantennary
glycans with different spacer-lengths was successfully printed on activated glass slides and tested with Lectins.
The use of glycan azides for pseudoproline assisted Lansbury aspartylation gave access to IL6 43-48 glycopeptide fragments. The synthesis of glycoconjugates with a lanthanide-tag allowed to determine the
global conformation of a biantennary N-glycan in solution for the first time by NMR spectroscopy.