Neue Aspekte im diffizilen Zusammenspiel der SMC-Ringkomplexe Cohesin und Condensin mit Komponenten der DNA-Replikationsmaschinerie

Titelangaben

Karich, Juliane:
Neue Aspekte im diffizilen Zusammenspiel der SMC-Ringkomplexe Cohesin und Condensin mit Komponenten der DNA-Replikationsmaschinerie.
Bayreuth , 2016 . - 189 S.
( Dissertation, 2015 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Der Multiproteinkomplex Cohesin hält die beiden, während der S-Phase synthetisierten Schwesterchromatiden zusammen und trägt somit zu deren fehlerfreien Segregation im Zuge der Mitose bei. Die chromosomale Rekrutierung des Cohesinkomplexes erfolgt in S. cerevisiae während der G1-Phase, in höheren Eukaryoten jedoch bereits in Telophase und bedarf der Anwesenheit des hochkonservierten Kollerinkomplexes (Scc2/Scc4). Dabei variiert die zugrunde liegende Rekrutierungskaskade interessanterweise in Abhängigkeit des Entwicklungszustands und des verwendeten Modellsystems deutlich. Während in Hefe, Drosophila melanogaster und Säugerzellen Cohesin vermittelt über Transkriptions-gekoppelte Mechanismen an die DNA dirigiert wird, haben diese Funktion in Extrakten aus Eiern des afrikanischen Krallenfroschs Xenopus laevis, in denen keine Gentranskription stattfindet, Replikations-assoziierte Faktoren übernommen. In diesem Modellsystem, in welchem sich charakteristische Ereignisse der späten Meiose bzw. der frühen Embryonalentwicklung nachvollziehen lassen, sind insbesondere Komponenten des präreplikativen Komplexes (pre-RC) maßgeblich an der Rekrutierung von Cohesin an das Chromatin beteiligt.

Überzählige Centrosomen sind ein charakteristisches Merkmal vieler Krebszellen und wirken sehr wahrscheinlich an der Entstehung von Tumoren mit. Die am Ende der Mitose erfolgende Trennung der Centriolen stellt eine wichtige Voraussetzung für die korrekte Centrosomenverdopplung während der S-Phase dar. Dieser, die Centrosomenzahl kontrollierende Lizensierungsschritt ermöglicht die genau einmalige Duplikation der Centrosomen innerhalb einer Zellzyklusrunde. Interessanterweise verhindert Cohesin nicht nur die vorzeitige Separation der beiden Schwesterchromatiden, sondern wirkt auch einer verfrühten Trennung der Centriolen entgegen. Dabei ist jedoch bislang unklar, auf welchem Wege Cohesin an die Centrosomen gelangt. Um dies näher zu beleuchten wurden im Rahmen dieses Teilprojekts Antikörper generiert und charakterisiert, mit deren Hilfe Cohesin sowie möglicherweise an seiner centrosomalen Lokalisation beteiligte Faktoren aus Xenopus-Eiextrakten eliminiert werden konnten. Unter Verwendung solcher spezifisch immundepletierer Extrakte ergaben sich erste Hinweise darauf, dass Replikations-gekoppelte Mechanismen nicht nur an der chromosomalen Rekrutierung von Co- hesin mitwirken, sondern letzteres auch an die Centrosomen dirigieren, um dort den engen Kontakt zwischen beiden Centriolen aufrecht zu erhalten und somit eine vorzeitige Centrosomentrennung zu unterbinden. Konsistent mit der Tatsache, dass die Duplikation von Centrosomen durch die räumliche Trennung der Cen- triolen lizensiert wird, resultierte die Eliminierung von Cohesin bzw. der für seine Rekrutierung essentiellen Faktoren in einer Überduplikation von Centrosomen in S-Phase-arretierten Eiextrakten.

Kerntransferexperimente und die damit eng verknüpfte Generierung autologer pluripotenter Stammzellen stellen eine entscheidende Grundlage zellbasierter Therapieansätze für eine Vielzahl von Erkrankungen dar. Allerdings zeigen solche Experimente eine sehr geringe Erfolgsquote, da ein einmal ausdifferenzierter Zellkern nur schlecht und unzureichend auf die Erfordernisse der frühen embryonalen Entwicklung angepasst ist. Mittels verschiedener experimenteller Ansätze konnte gezeigt werden, dass nach Vorbehandlung der differenzierten Zellkerne in einer (quasi-)mitotischen Umgebung die Fehlerrate von Kerntransplantationen deutlich verringert werden kann, wobei nicht der zusätzliche Zeitgewinn sondern die Aktivität mitotischer Faktoren eine tragende Rolle zu spielen scheint. Letztere formen das Chromatin eines ausdifferenzierten Zellkerns so um, dass die Verdopplung der DNA in der nachfolgenden S-Phase fast genauso schnell und effizient ablaufen kann, wie dies in den Zellen früher Embryonen der Fall ist. Neben weiteren Modifikationen werden im Rahmen einer solchen Restrukturierung die Windungen der chromosomalen DNA um das protein-haltige Kerngerüst dichter gepackt, wobei sich die Länge der einzelnen DNA-Schleifen deutlich verkürzt. Mittels geeigneter Methoden, wie etwa der Maximum Fluorescence Halo Technique (MFHT) oder dem molekularen Combing von DNA-Fäden, lässt sich die Umorganisation der Chromosomenstruktur experimentell gut verfolgen. Über die Identität hieran teilnehmender Faktoren ist bislang allerdings nur wenig bekannt. Als ein möglicher Kandidat bietet sich der Multiproteinkomplex Condensin an, ist er doch an der strukturellen und funktionellen Organisation des Chromatins sowohl in der Interphase als auch während der Mitose maßgeblich beteiligt. Um zu klären, ob Condensin tatsächlich in die chromosomale Reorganisation während der Mitose involviert ist, sollten ausdifferenzerte Xenopus-Zellkerne aus mitotischen Eiextrakten reisoliert werden, denen Condensin zuvor entzogen worden war. Hierfür wurden zunächst Antikörper generiert, welche eine spezifische Eliminierung des Condensinkomplexes ermöglichten. Um die chromosomale Konfiguration beurteilen zu können, wurden zudem die beiden experimentellen Methoden der MFHT und des molekularen Combings etabliert. Trotz vielversprechender Anfänge gelang es in dem zur Verfügung stehenden Zeitrahmen leider nicht, deren Verlässlichkeit und Reproduzierbarkeit so weit zu verbessern, dass eine Anwendung auf ausdifferenzierte, in Condensin-depletierten Xenopus-Eiextrakten vorinkubierte Zellkerne sinnvoll erschien.

Abstract in weiterer Sprache

The multi-subunit complex cohesin, which holds sister chromatids together and therefore accounts for precise chromosome segregation in anaphase, is loaded onto chromatin during the previous telo- and G1 phase in higher eukaryotes and S. cerevisiae, respectively. Upstream of the conserved kollerin complex (Scc2/Scc4) the underlying cohesin recruiting cascade varies with developmental stage and model organism. Cohesin is directed onto DNA by transcription-coupled mechanisms in yeast, Drosophila melanogaster and mammalian cells, whereas this function is taken over by replication-associated factors in transcription-incompetent egg extracts of the African clawed frog, Xenopus laevis. Within this late meiotic/early embryonic model system components of the pre-replicative complex (pre-RC) not only define licensed origins of replication but also recruit cohesin to chromatin.

Supernumerous centrosomes are a common feature of many tumor cells and likely contributing to the development of cancer. Duplication of centrosomes in S phase requires a preceding licensing step in late mitosis, centriole disengagement, which ensures that centrosomes are duplicated once and only once per cell cycle. Interestingly cohesin not only prevents premature separation of sister chromatids but also seems to counteract an untimely disengagement of centrioles, although until now it is not clear, how cohesin is targeted towards centrosomes. To answer this question in this project polyclonal antibodies were generated, which allow the elimination of both cohesin and its putative recruitment factors out of Xenopus egg extracts. Using such immunodepleted extracts provides first hints that DNA replication-coupled mechanisms are involved in the loading of cohesin onto centrosomes as it is the case for chromosomes. Furthermore, consistent with centriole disengagement licensing centrosome duplication, the absence of cohesin or its putative recruiting factors resulted in overduplication of centrosomes in S phase arrested egg extracts.

Nuclear transfer experiments are a powerful tool for cell-based therapies for various diseases but often fail due to the difficulties in reprogramming the differentiated nuclei for the early developmental events. Using different experimental approaches it has been shown that the efficiency for such experiments is raised when the nuclei are delivered in a mitotic(-like) environment where they are enabled to adopt a favourable constitution for an efficient DNA replication in the following S phase as it is the case for early embryonic cells. Amongst others this nuclear reprogramming implicates a tighter winding of the chromosomal DNA on the proteinous chromosome scaffold which can be visualized via maximum fluorescence halo technique (MFHT) and molecular combing analysis. Until now few is known about the identity of factors involved in the reorganisation of the chromosomal structure at the transition from M to S phase of the cell cycle. One possible candidate for this challenge is the multi-protein complex condensin which is identified as a key player in chromosome reorganisation events both in interphase and mitosis. To clarify condensin’s putative involvement in the process of chromosomal reorganisation during mitosis differentiated nuclei from Xenopus laevis should reisolated out of specific immunodepleted egg extracts. Therefore antibodies were generated which allow the specific elimination of the condensin complex. To estimate the chromosomal constitution both MFHT and molecular combing were established, too. Despite promising beginnings it was not possible to improve the reliability and the reproducibility of both experimental procedures. Therefore an application to differentiated nuclei reisolated from condensin-depleted Xenopus egg extracts seemed not reasonable.