Metabolic Pathways of Amino Acids, Monosaccharides and Organic Acids in Soils assessed by Position-Specific Labeling

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Dippold, Michaela A.:
Metabolic Pathways of Amino Acids, Monosaccharides and Organic Acids in Soils assessed by Position-Specific Labeling.
Bayreuth , 2014 . - XX, 295, A3 S.
( Dissertation, 2013 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Transformation of low molecular weight organic substances (LMWOS) is one of the most important steps in biogeochemical cycles since all high molecular substances pass this stage during their decomposition. Microbial utilization is the most relevant sink for LMWOS in soils and thus knowledge about microbial transformations of LMWOS is crucial for understanding the soil organic carbon (SOC) cycle and predicting its reaction to changes in controlling environmental parameters. Previous studies focused on determining fluxes through the LMWOS pool, but they rarely identified transformation steps. This thesis aims to establish position-specific isotope labeling as a tool in soil science to trace the pathways of LMWOS transformations.
In a mediumterm field experiment six position-specific 13C-labeled LMWOS from the three main LMWOS classes were applied: two amino acids (alanine and glutamate), two monosaccharides (glucose and ribose) and two organic acids (acetate and palmitate). C-13 remaining in soil and that incorporated into microbial biomass and specific microbial cellular compounds (phospholipid fatty acids (PLFA) and amino sugars) was determined by bulk and compound-specific C-13 analyses. Therefore, a new instrument coupling, an ion chromatograph with an isotope ratio mass spectrometer (IC-O-IRMS), and the respective methods for amino sugar analysis were established. The effect of altered environmental conditions and the relevance of further LMWOS sinks (sorption or plant uptake) were evaluated in several additional laboratory experiments based on position-specific C-14-labeling. The divergence index (DI) was established to compare the position-specific fate of individual substances in various studies independent of the isotopic approach or experimental design used or the pool investigated.
Microbial utilization was the fastest process in the removal of LMWOS from soil solution and neither plant uptake nor sorption could out-compete microorganisms. The incorporation of individual molecule positions in soils, microbial biomass and distinct compound classes was clearly defined by the microbial metabolism: Glycolysis, oxidation by pyruvate dehydrogenase and the citric acid cycle were identified as the main metabolic processes. However, in addition to these oxidizing catabolic pathways, the anabolic pathways, i.e. building-up new cellular compounds, occurred in soils simultaneously. This involved an intensive C recycling and turnover within the microorganisms that was observed not only for cytosolic compounds but also for cell wall polymers. Intensive modifications and transformation within metabolic side branches, like the fatty acid formation and transformation pathways, were identified. These results for fatty acid transformations are crucial for their application as plant biomarkers in studies on palaeoenvironmental reconstruction.
The combination of position-specific C-13-labeling with compound-specific isotope analysis of microbial biomarkers allowed the further identification of specific pathways of individual functional microbial groups in soils. Fungal metabolism was shown to be slower than bacterial intracellular C recycling and turnover, which provides the metabolic reason for the slow-cycling fungal-based and fast-cycling bacteria-based branch of the soil food web. Shifts in C allocation through various metabolic pathways were dependent on environmental factors: a gradient of C metabolism from starvation pathways via maintenance metabolism to metabolic pathways characteristic for microbial growth was observed with increasing substrate concentration. Sorption, also limiting the bioavailability of a substrate, caused similar shifts in metabolic pathways: the lower the bioavailability (e.g. due to sorption), the more C was allocated towards anabolic biosynthesis, i.e. into microbial products. Thus, these studies revealed that position-specific labeling is not only a valuable tool in biochemistry for metabolic flux analysis, but also enables the reconstruction of metabolic pathways of LMWOS within diverse microbial communities in complex media such as soil. Processes occurring simultaneously in soil i.e. 1) within individual, reversible metabolic pathways, 2) in various microbial groups or 3) in specific microhabitats (like on mineral surfaces, at the soil-plant interface or at hot-spots versus bulk soil) could be traced by position-specific labeling in soils in situ.
The main metabolic pathways of microbial LMWOS transformation by cata- and anabolism were traced by position-specific labeling. These pathways and their regulating factors are crucial for assessing C flows towards mineralization versus the formation of microbial bio-mass, the prerequisite for the formation of microbially-derived SOC. This molecular knowledge of transformation steps and their regulating factors is crucial to predict (i.e. by new process-based modelling approaches) and manipulate C allocation and stabilization in soils.

Abstract in weiterer Sprache

Die Transformation niedermolekularer organischer Substanzen (LMWOS) ist der zentrale Schritt in biogeochemischen Kreisläufen, da alle hochmolekularen Substanzen während ihres Abbaus den LMWOS Pool passieren. Mikroorganismen stellen die bedeutendste Senke für LMWOS dar, weshalb mikrobielle Transformationen von LMWOS essentiell für den Kohlenstoffkreislauf im Boden sind. Bisherige Studien quantifizierten meist Flüsse durch den LMWOS Pool, arbeiteten aber kaum an der Aufklärung der Transformationsprozesse. Im Rahmen dieser Dissertation soll die positionsspezifische Isotopenmarkierung als neue bodenkundliche Methode zur Aufklärung von LMWOS-Transformationswegen etabliert werden.
In einem Feldexperiment wurden sechs positionsspezifisch C-13 markierte LMWOS der drei wichtigsten Substanzklassen appliziert: zwei Aminosäuren (Alanin und Glutamat), zwei Monosaccharide (Glucose und Ribose) und zwei organische Säuren (Acetat und Palmitat). Die Analyse von verbleibendem C-13 im Boden, C-13 in der mikrobiellen Biomasse und in spezifischen Zellbausteinen (Phospholipidfettsäuren (PLFA) und Aminozucker) erfolgte durch gesamt- und komponentenspezifische C-13 Methoden. Hierfür wurde eine neue Instrumentenkopplung – ein Ionenchromatograph mit einem Isotopenmassenspektrometer (IC-O-IRMS) – etabliert und die darauf abgestimmte Aminozucker-Aufreiningungsmethode eingearbeitet. Der Effekt sich ändernder Umweltfaktoren sowie die Relevanz weiterer LMWOS-Senken (Sorption und Pflanzenaufnahme) wurden anhand mehrerer zusätzlicher Laborexperimente mit positionsspezifischer 14C Markierung evaluiert. Die Einführung des Divergenz Index (DI) ermöglichte es den positionsspezifischen Einbau in verschiedenen Studien unabhängig vom applizierten Isotop, dem experimentellen Design und dem untersuchten Pool zu vergleichen.
Mikroorganismen waren die dominante Senke für LMWOS und weder Pflanzenaufnahme noch Sorption konnten in Rate und Kinetik mit mikrobiellen Aufnahmesystemen konkurrieren. Der Einbau einzelner Molekülpositionen in Boden, mikrobielle Biomasse und bestimmte Substanzklassen war durch den mikrobiellen Metabolismus bestimmt, v.a. durch Glykolyse, Oxidation durch Pyruvat-Dehydrogenase und Citratzyklus. Allerdings liefen parallel zu diesen oxidierenden, katabolen Stoffwechselwegen auch anabole Reaktionen, d. h. der Aufbau neuer Zellkomponenten, ab. Dies führte zu einem starken C-Umsatz und Recycling, nicht nur im Cytosol sondern z.B. auch von Zellwandpolymeren. Intensive Umsätze innerhalb metaboler Seitenäste, wie der Fettsäurebiosynthese, wurden identifiziert. Diese Ergebnisse zur Fettsäuretransformation sind wesentlich für die Anwendung von Fettsäuren als pflanzliche Biomarker in Paläoumweltstudien.
Die Kombination positionsspezifischer C-13 Markierung mit komponentenspezifischer Isotopenanalytik mikrobieller Biomarker erlaubte des Weiteren die Identifikation spezifischer Stoffwechselwege einzelner mikrobieller Gruppen. Pilze zeigten einen langsameren intrazellulären C-Umsatz als Bakterien, was die metabole Grundlage für den langsam-zyklierenden, pilzbasierten und den schnell-zyklierenden, bakterienbasierten Zweig des Bodennahrungsnetzes liefert. Die Verschiebungen der Kohlenstoffflüsse durch verschiedene Stoffwechselwege wurden in Abhängigkeit von Umweltfaktoren identifiziert: Mit Zunahme der Substratkonzentration konnte ein Gradient von C-Mangel-Stoffwechselwegen über den Erhaltungsmetabolismus hin zu charakteristischen Wachstums-Stoffwechselwegen beobachtet werden. Eine Verringerung der Substratverfügbarkeit durch Sorption verursachte eine ähnliche Ver-schiebung der metabolen C-Flüsse: Je niedriger die Verfügbarkeit, desto mehr C wird in Biosynthesewege also mikrobielle Produkte, verlagert.
Diese Studien konnten zeigen, dass positionsspezifische Markierung nicht nur eine wertvolle Methode in der Biochemie darstellt, sondern auch die Aufklärung der Verstoffwechslung von LMWOS durch diverse mikrobielle Gemeinschaften in komplexen Medien wie dem Boden ermöglicht. Parallel ablaufende Prozesse in Böden wie z. B. 1) der Rückfluss durch reversible Stoffwechselwege, 2) Umsätze in verschiedenen mikrobiellen Gruppen oder 3) Umsätze in spezifischen Mikrohabitaten (an Mineraloberflächen, am Boden-Pflanze-Interface oder an Hot-spots versus dem Gesamtboden) können mittels positionspezifischer Markierung im Boden in situ verfolgt werden.
Der Umsatz von LMWOS in Kata- und Anabolismus wurde im Rahmen dieser Dissertation rekonstruiert. Das Verständnis für diese Stoffwechselwege und ihre Regulationsfaktoren ist entscheidend für die Beurteilung von C-Flüssen zwischen Mineralisation und dem Aufbau mikrobieller Biomasse – der Voraussetzung zur Bildung mikrobieller, organischer Bodensubstanz. Das Wissen über Transformationsschritte und ihre regulierenden Faktoren ist essentiell für die Vorhersage (z. B. mittels prozessbasierter Modellierung), aber auch für die Manipulation der C-Sequestrierung und Stabilisierung in Böden.