Retinoic acid signaling in zebrafish fin regeneration

Titelangaben

Blum, Nicola:
Retinoic acid signaling in zebrafish fin regeneration.
Bayreuth , 2016 . - 157 S.
( Dissertation, 2016 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

Volltext

Link zum Volltext (externe URL):

Angaben zu Projekten

Abstract

Teleost fish and urodele amphibians are unique among vertebrates in that they possess the ability to replace limbs and fins with the exact replicates of the original throughout life by epimorphic regeneration. Following appendage amputation, a pool of lineage-restricted highly-proliferative mesenchymal cells (the so called blastema) forms at the site of regeneration, from which the lost appendage faithfully regrow.
For this thesis, I have investigated the functions of retinoic acid (RA) signaling in zebrafish fin regeneration. I demonstrate that RA signaling is an essential component of the genetic network underlying blastema formation and subsequent proliferation and survival of blastema cells. Synthesis of RA becomes upregulated within the first hours after fin amputation close to the amputation site, where it is required to mobilize cell division in post-mitotic stump cells that will give rise to the blastema. Genetic inhibition of RA signaling upon fin amputation causes suppression of blastema formation and failure of fin regeneration. RA synthesis remains high in the mature blastema and drives regenerative outgrowth by promoting blastema proliferation. The blastema is a mass of fast-cycling cells in an adult animal, raising the question of why blastema cells are not eliminated due to anti-cancer mechanisms. My findings indicate that blastema cells evade cell death by elevated levels of the anti-apoptotic factor Bcl2, the expression of which is positively regulated by RA signaling.
The zebrafish caudal fin is supported by several bony fin rays, derived from intramembranous ossification, which run from proximal to distal and are separated by soft interray tissue. Rapid replacement of lost bone during fin regeneration is achieved via dedifferentiation of osteoblasts from a post-mitotic, matrix-producing state to a cycling, immature preosteoblastic state, and vice versa, redifferentiation to a mature state. Here, I demonstrate that RA signaling inhibits switching between the mature and immature state while promoting osteoblast proliferation and bone matrix synthesis and unravel how the osteoblast regenerative program is achieved against continued RA synthesis during fin regeneration. Stump osteoblasts that participate in blastema formation transiently produce Cyp26b1, an enzyme that inactivates RA. This elegant mechanism allows the establishment of an osteoblast progenitor pool despite raising RA levels in the fin stump. Preosteoblasts pass through a number of cell divisions in the distal blastema where RA synthesis is high, whereas more proximal cells redifferentiate to form new bone. Fibroblasts-like blastema cells in those areas of redifferentiation lower local RA concentrations via Cyp26b1 activity, thereby ensuring redifferentiation of osteoblasts. This allows two processes to run in parallel: Proliferation for the continuous supply of osteoblasts in the distal part and redifferentiation of osteoblasts more proximally where the fin rays re-emerge.
During fin regeneration, osteoblasts have to respect fin ray-interray borders in order to faithfully reestablish the original fin pattern. However, why preosteoblast remain restricted to ray regions and do not invade the regenerating interray tissue has so far been unresolved. Here, I show that epidermal niches of low RA levels are established in regions where new rays are to form. This allows the spatially restricted production of a signal that pilots preosteoblasts to target regions. Interestingly, it emerged that osteoblasts themselves exert a piloting function for other cell types that also have to be directed to appropriate regions.

Abstract in weiterer Sprache

Knochenfische und Schwanzlurche können ihr ganzes Leben hindurch ihre Gliedmaßen vollständig nachwachsen lassen. Diese Fähigkeit ist einzigartig unter Wirbeltieren und beruht auf dem Prozess der epimorphen Regeneration. Nach Amputation einer Gliedmaße wird ein sogenanntes Blastem, das aus sich schnell-teilenden, gewebetreuen Zellen besteht, an der Amputationswunde gebildet. Aus dem Blastem wird der verlorene Teil der Gliedmaße regeneriert.
Im Rahmen dieser Dissertation wurden die Funktionen des Retinsäure Signalweges während der Flossenregeneration im Zebrafisch untersucht. Hierbei konnte gezeigt werden, dass der Retinsäure Signalweg eine entscheidende Rolle während der Blastembildung spielt und anschließend für die Proliferation und das Überleben der Blastemzellen benötigt wird. Innerhalb weniger Stunden nach der Amputation wird die Synthese von Retinsäure im Stumpfgewebe hochreguliert. Postmitotische mesenchymale Blastem-Vorläuferzellen benötigen die erhöhte Retinsäure-Konzentration, um in den Zellzyklus einzutreten. Wird der Retinsäure Signalweg blockiert, so kann sich kein Blastem bilden, und die Flosse wächst nicht nach. Nachdem sich das Blastem gebildet hat, wird Retinsäure weiterhin benötigt, um die Proliferation der Blastemzellen sicherzustellen und dadurch das regenerative Auswachsen voranzutreiben.
Das Blastem ist eine Ansammlung von sich schnell-teilenden Zellen. Es stellt sich deshalb die Frage, warum Blastemzellen in einem erwachsenen Tier überhaupt überleben können und nicht aufgrund von Mechanismen, welche normalerweise die Entstehung von Tumoren verhindern, eliminiert werden. In diesem Zusammenhang konnte ich zeigen, dass Blastemzellen aufgrund einer erhöhten Konzentration des anti-Apoptose-Faktor Bcl2 überleben können. Die Expression von bcl2 wird durch Retinsäure gefördert.
Die Schwanzflosse des Zebrafisches wird durch knöcherne Flossenstrahlen verstärkt. Flossenstrahlen entstehen durch desmale Ossifikation und verlaufen parallel zur proximal-distalen Flossenachse. Zwischen den einzelnen Flossenstrahlen befindet sich weiches Zwischenstrahlgewebe. Die rasche Regeneration der Flossenstrahlen nach der Amputation wird durch eine temporäre Dedifferenzierung von ausdifferenzierten Osteoblasten sichergestellt. Diesbezüglich konnte ich zeigen, dass Retinsäure sowohl die Dedifferenzierung als auch die anschließende Rückdifferenzierung der Osteoblasten verhindert. Die Proliferation der Osteoblasten und die Produktion von Knochenmatrix wiederum werden von Retinsäure gefördert. Osteoblasten im Stumpf müssen sich vor Retinsäure schützen, um dedifferenzieren zu können. Hierfür produzieren Osteoblasten Cyp26b1, ein Retinsäure-abbauendes Enzym. Mit Hilfe von Cyp26b1 können Osteoblasten im Stumpf dedifferenzieren und zu Blastemzellen werden. Nach mehreren Zellteilungen im distalen Bereich des Regenerats differenzieren Osteoblasten wieder zu Matrix-produzierenden Knochenzellen. Eine erhöhte Retinsäure-Konzentration im distalen Regenerat fördert die Proliferation der dedifferenzierten Osteoblasten. In proximalen Regionen wird Retinsäure hingegen durch Cyp26b1 in Fibroblasten abgebaut. Durch diesen Mechanismus kann sichergestellt werden, dass sich Osteoblasten in proximalen Bereichen nicht weiter teilen und stattdessen differenzieren.
Osteoblasten müssen während der Flossenregeneration die Grenzen der Flossenstrahlen respektieren und dürfen nicht in das Zwischenstrahlgewebe einwandern. Nur so kann das ursprüngliche alternierende Muster von Knochenstrahlen und Zwischenstrahlgewebe wieder
hergestellt werden. Wie dies erreicht wird, war bisher völlig unklar. Hier konnte ich zeigen, dass bestimmte Regionen in der Epidermis Retinsäure abbauen und dadurch die Produktion eines Signals ermöglichen, welches die Osteoblasten an die richtigen Stellen im Regenerat lotst. Andere Zelltypen wiederum orientieren sich an den Osteoblasten.