A mechanistic assessment of novel anticancer drugs targeting the metastatic cascade and tumour vascularisation.

Titelangaben

Mahal, Katharina:
A mechanistic assessment of novel anticancer drugs targeting the metastatic cascade and tumour vascularisation.
Bayreuth , 2015 . - IV, 260 S.
( Dissertation, 2015 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Angiogenesis, the process of induced blood vessel sprouting and vascularisation are essential for the growth and progression of solid tumours. Recruitment of blood vessels is also an important step of the metastatic cascade that enables development of macrometastasis and growth to secondary tumours. Thus, intratumoral blood vessels represent an important target for anticancer drugs. The two classes of antivascular chemotherapeutics are vascular-disrupting agents (VDA) that target already established tumour blood vessels, and compounds with antiangiogenic acitivity that interfere with processes during the formation of new blood vessels.
Most vascular-disrupting agents bind to tubulin and mediate blood vessel destruction by secondary effects ensuing microtubule destabilisation. These include or are based on actin cytoskeleton reorganisation, cellular contractility and endothelial permeability. Eventually, the loss of the tightly-organised monolayer integrity of the endothelium results in blood vessel disruption and intratumoral haemorrhages.

The tubulin-binding agents discussed in this thesis are derived from the synthetic quinazoline derivate Verubulin or the natural drug Combretastatin A-4 (CA-4). Their preclinical evaluation includes the determination of their in vitro cytotoxicity profile against a panel of different tumour cells lines and various biochemical and immunological methods to clarify their molecular and cellular mechanism of action. Both antimetastatic and antivascular activity of the best derivatives were assessed in vitro by using endothelial or tumour cell-based assays or in vivo by analyses of developing blood vessels within in the chorioallantois membrane (CAM) of chicken embryos.
CA-4-derived oxazole and imidazole analogues that were synthesised and developed at the Chair of Organic Chemistry of the University of Bayreuth were able to overcome typical drawbacks of clinical CA-4 phosphate prodrugs including their short plasma half-life and metabolic instability as well as the induction of multidrug resistance (MDR)-mediating overexpression of efflux transporters. Unlike CA-4, imidazoles are chemically stable and do not undergo isomerisation into the inactive trans-configuration of the CA-4 stilbene motiv. Additionally, they are not recognised by MDR-transporters of cancer cell lines that are refractory to CA-4. In in vitro experiments, active derivatives led to extensive microtubule depolymerisation which we could correlate to their cytotoxicty and vascular-disrupting activity. The latter is a consequence of typical effects such as actin cytoskeleton remodelling and defective cellular adhesion dynamics. In addition, these drug-induced cytoskeletal alterations are also the origin of decreased tumour cell motility and reduced invasive behaviour. One of the most promising derivatives which is designated with its short name Brimamin, was shown to mediate perturbation of nuclear NF-kappaB signalling. Interference with this resistance mediator has not been described for CA-4 and is different from the mode of action of other antiangiogenic agents.

A second generation of CA-4-derived imidazoles with acrylic hydroxamic acid appendages were shown to combine histone deacetylase (HDAC) inhibition with synergistic effects of the 4,5-diarylimidazole residue. Some of the derivatives proved a greater cytotoxicity against a panel of resistant cell lines and a higher specificity for cancer over non-malignant cells then the clinical approved HDAC inhibitor Vorinostat. The imidazoles also exceeded the antimetastatic in vitro acitivity and the antiangiogenic in vivo activity of Vorinostat. Like the latter, the best derivatives were shown to act as so called pan-HDAC inhibitors with unspecific inhibition of all Zn(II)-dependent HDAC isoenzymes, but a higer specificity for the tubulin deacetylase HDAC6. As a consequence, treatment with the best performing derivative with the short name Etacrox led not only to hyperacetylation of microtubules but also induced severe alterations in cytoskeletal and focal adhesion dynamics. An additional mode of action unique for the new imidazole-based HDAC inhibitors is the direct inhibition of matrix metalloproteinases (MMPs) which are known to promote angiogeneses and metastasis. The latter of pleiotropic effects together with HDAC inhibition-mediated perturbation of pro-angiogenic signalling cascades apparently mediates the strong antiangiogenic and antimetastatic effects. Altogether, the high tolerance of large doses in mice and their multitargeted anticancer effects make the 4,5-diarylimidazole HDAC inhibitors a promising class of new drug candidates for clinical applications.

Abstract in weiterer Sprache

Die Ausbildung von intratumoralen Blutgefäßen und die Vaskularisierung solider Tumore ist ein essentieller Prozess für Tumorwachstum, Tumorprogression und Metastasierung und stellt somit ein wichtiges Target für Chemotherapeutika dar. Man unterscheidet dabei zwischen vaskular-disruptiven Wirkstoffen, die in der Lage sind, bereits bestehende Blutgefäße zu zerstören, und antiangiogenen Wirkstoffen, die in verschiedene Prozesse der Angiogenese, der Neubildung von Blutgefäßstrukturen, eingreifen können.

Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden Verbindungen aus der Klasse Tubulin-bindender Substanzen untersucht, die den größten Anteil an heute bekannten vaskular-disruptiven Agenzien (VDA) darstellen. Ihr primäres Target ist das Zytoskelett von Endothelzellen, die in Tumorumgebung aufgrund der kontinuierlichen Wachstumsfaktor-Stimulation oft fehlstrukturierte und entartete Blutgefäße bilden. Sie sind daher besonders anfällig für die zellulären Sekundäreffekte in Folge depolymerisierter Mikrotubuli. Diese beinhalten die erhöhte endotheliale Permeabilität und die vermehrte Kontraktilität einzelner Zellen innerhalb der hoch organisierten Endothelzellschicht und führen letztlich zum Verlust von Endothelintegrität und der Zerstörung der Blutgefäßstruktur.
Die präklinische Evaluation von Mikrotubuli-destabilisierenden Derivaten beschäftigte sich dabei zunächst mit der Bestimmung der in vitro-Toxizität der hier gezeigten Referenzsubstanzen und deren Analoga an kultivierten Krebszelllinien verschiedenster Entitäten sowie mit der zellbiologischen und biochemischen Untersuchung ihrer Wirkmechanismen und daran beteiligter Signaltransduktionswege. Das antimetastatische und antivaskuläre Potential ausgewählter Derivate wurde in vitro an verschiedenen Zelltypen und in vivo anhand des sich entwickelnden Blutgefäßsystems innerhalb der Chorioallantoismembran von Hühnerembryos untersucht (CAM-Assay).
Bei weiteren, hier gezeigten Mikrotubuli-destabilisierenden Substanzen handelt es sich neben einer Serie von bizyklischen Heteroaryl-Anloga von Verubulin, einem synthetischen Quinazolin-Derivat, ausschließlich um Oxazol- und Imidazol-Analoga des Naturstoffs Combretastatin A-4 (CA-4). Phosphat-Prodrugs von verschiedenen Combretastatinen sind aktuell in klinischen Studien oder bereits für klinische Anwendungen zugelassen, besitzen aber neben ihrer geringen Plasma-Halbwertszeit und Tendenz zu metabolischer Isomerisierung in inaktive Konformationen oft weitere Nachteile wie die Vermittlung von Multiresistenzen gegen verschiedene Zytostatika während der ersten Behandlungszyklen. Die am Lehrstuhl für Organische Chemie I der Universität Bayreuth entwickelten, zum Teil halogenierten Oxazol- und Imidazol-Derivate umgehen diese Nachteile durch Stabilisierung der bioaktiven Konfiguration und strukturelle Veränderungen der CA-4-Leitstruktur, die eine Erkennung durch Multidrug Resistance-Effluxtransporter und somit die Detoxifizierung der Zelle verhindern. Die effektivsten Derivate vermitteln die Störung der Zytoskelett-Dynamik, im Einzelnen die vermehrte Mikrotubuli-Depolymerisation, die Induktion der Aktin-Zytoskelett-Stressantwort und die Beeinflussung der zellulären Fokaladhäsionsdynamik. Diese Effekte haben nicht nur vaskular-disruptive und antiangiogene Wirkung, sondern auch eine erheblichen Beeinträchtigung der Migrationfähigkeit von Tumorzellen zur Folge. Aktuelle in vitro-Studien mit einem der effektivsten Imidazol-Analoga (Brimamin) an Endothelzellen zeigten zudem eine für CA-4 bislang nicht beschriebene Inhibition des Resistenz-vermittelten NF-kappaB-Signalwegs. Diese Modulation von Resistenz-Regulatoren ist ein Mechanismus, in dem sich Brimamin deutlich von anderen antiangiogenen Substanzen unterscheidet und unterstreicht somit das enorme Potential dieser CA-4-abgeleiteten Wirkstoffklasse für die klinische Anwendung als Chemotherapeutika mit verbesserter antivaskulärer und antimetastatischer Wirkung.

Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Charakterisierung von Substanzen, die eine Weiterentwicklung dieser ersten Generation von CA-4-abgeleiteten Imidazolen darstellt. Die Erweiterung des ursprünglichen CA-4-Phenolrings um Acrylhydroxamsäure-Reste führte zu einer neuen Klasse hoch effizienter 4,5-Diarylimidazol-baiserter Histondeacetylase-Inhibitoren (HDACi), die die Wirkung von bereits klinisch etablierten Hydroxamsäure-Analoga wie Vorinostat vor allem im Hinblick auf ihre antimetastatischen und antiangiogenen Aktivität übertrifft. Beide Substanzen vermitteln die unspezifische Inhibition von Histondeacetylase (HDAC)-Isoformen, während die effektivsten, hier gezeigten Derivate im Vergleich zu den typischen HDACs höhere Selektivität für die zytoplasmatische Tubulin-Deacetylase HDAC6 besitzten. Anders als viele Hydroxamsäure-HDACi sind die Imidazol-Derivate zudem in der Lage, pro-metastatische und pro-angiogene Matrix-Metalloproteinasen zu inhibieren. Die Induktion einer Vielzahl von zellulären Effekten wie der Fehlregulation von Zytoskelettdynamik, der Hemmung von proliferations- und differenzierungsrelevanten Signalkaskaden und der direkten Inhibition von Metastase-vermittelnden Proteinasen scheinen zu den vielversprechenden antimetastatischen und antiangiogenen Effekten dieser neuartigen Verbindungen beizutragen.